SB2301

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 300 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Lipidtröpfchen (LDs) sind neben ihrer primären Rolle als Speicherzentrum für neutrale Lipide an verschiedenen biologischen Vorgängen in Zellen beteiligt. Eine übermäßige Anreicherung von LDs steht in engem Zusammenhang mit verschiedenen Krankheiten, einschließlich Stoffwechselerkrankungen. Daher wäre ein grundlegendes Verständnis des molekularen Mechanismus des LD-Abbaus sowohl für die akademische als auch für die industrielle Forschung von Vorteil. Lipophagie, ein selektiver Autophagiemechanismus/LD-Abbauprozess, hat in der Forschungsgemeinschaft zunehmend Aufmerksamkeit erregt. Hier versuchten wir, einen neuartigen Lipophagie-Mechanismus aufzuklären, indem wir das LD-abbauende kleine Molekül SB2301 nutzten, das die Ubiquitin-vermittelte Lipophagie aktiviert. Mithilfe einer markierungsfreien Zielidentifizierungsmethode haben wir gezeigt, dass Ethanolaminphosphat-Cytidylyltransferase 2 (PCYT2) ein potenzielles Zielprotein von SB2301 ist. Wir haben auch gezeigt, dass SB2301 zwar die PCYT2-Funktion nicht moduliert, aber die zelluläre Translokation von PCYT2 zur LD-Oberfläche induziert und das Phosphatidylethanolamin (PE)/Phosphatidylcholin (PC)-Verhältnis der LD-Membran räumlich erhöht, was zu einer LD-Koaleszenz führt, die zur Aktivierung führt des Lipophagieprozesses zur Aufrechterhaltung der Energiehomöostase.

Lipidtröpfchen (LDs) sind spezialisierte Organellen, die zelluläre freie Fettsäuren (FFAs) als neutrale Lipide wie Triacylglycerin (TG) oder Sterolester (SE) speichern, um FFA-Lipotoxizität zu vermeiden1,2. Bei LDs sind neutrale Lipide von Phospholipiden wie Phosphatidylcholin (PC) und Phosphatidylethanolamin (PE)3 sowie Oberflächenproteinen wie der Perilipinfamilie4 und Lipasen5 umgeben. Zellen erzeugen oder bauen LDs dynamisch als Reaktion auf Umweltveränderungen ab, um die Energiehomöostase aufrechtzuerhalten und den Lipidstoffwechsel zu regulieren6.

Lipasen auf der LD-Oberfläche bauen hauptsächlich neutrale Lipide ab, wenn Zellen einen LD-Abbau benötigen7,8. Singh et al. berichteten, dass LDs ein Substrat der selektiven Autophagie, der sogenannten Lipophagie, sein könnten, die LD unter Hungerbedingungen in Autophagosomen bindet9. Die biomedizinische Forschungsgemeinschaft hat am Mechanismus der Lipophagie gearbeitet, um verschiedene Rollen von LDs über die Speicherung neutraler Lipide hinaus aufzudecken10, wie z. B. zelluläre Stressmodulation11,12, Proteinfunktionsregulation13,14 und Speicherung anderer Biomoleküle15,16. Daher kann die Untersuchung des LD-Regulationsmechanismus aufgrund seiner Relevanz in den Bereichen chemische Biologie und Arzneimittelforschung wertvolle Informationen zur Definition der zugrunde liegenden biologischen Pfade liefern. Darüber hinaus wurde kürzlich die physiologische Relevanz von LDs bei Stoffwechselerkrankungen betont. Die LD-Anreicherung im Muskel und in der Leber ist ein Kennzeichen von Stoffwechselerkrankungen, einschließlich Steatose17,18, Typ-2-Diabetes19,20 und Arteriosklerose21,22. Daher hat sich die Lipophagie als neue Strategie zur Behandlung solcher Krankheiten herausgestellt, insbesondere von Steatose und Lebererkrankungen23,24,25.

Darüber hinaus war der phänotypbasierte Ansatz eine wichtige Strategie zur Entdeckung neuer molekularer Einheiten mit neuartigen Wirkungsweisen. In dieser Studie führten wir ein bildbasiertes High-Throughput-Screening durch, um die Anzahl und Größe zellulärer LDs als entscheidende Phänotypen in lebenden Zellen zu überwachen. Wir untersuchten außerdem ein neues kleines Molekül, SB2301, um die Ubiquitin-vermittelte Lipophagie als neuen Regulationsmechanismus von LDs zu untersuchen. Mit SB2301 haben wir einen neuen Lipophagie-aktivierenden Mechanismus entdeckt, der den LD-Abbau durch räumliche Veränderung der Lipidzusammensetzung der LD-Membranen induziert.

Zunächst führten wir ein bildbasiertes phänotypisches Screening zellulärer LDs in lebenden Zellen durch, um potenzielle Modulatoren zellulärer LDs zu identifizieren. Zuvor haben wir über die fluorogene Sonde SF44 berichtet, die in lebenden Zellen über eine hydrophobe LD-selektive Aktivierungseigenschaft verfügt. Wir haben auch die Anwendung von SF44 auf die Fluoreszenzbildgebung im Hochdurchsatzverfahren mit einem hervorragenden Z′-Faktor27 demonstriert. Das SF44-basierte LD-Überwachungssystem mit SF44 ermöglicht die Echtzeitbeobachtung der zellulären LD-Dynamik, ohne dass Waschschritte erforderlich sind. Daher haben wir dieses System zur Überwachung hoher LD-Gehalte in lebenden Zellen angewendet, um neue chemische Einheiten zu identifizieren, denen es an Zelltoxizität mangelt und die nur minimale Einflüsse anderer externer Faktoren haben.

Wir haben zuvor über eine Reihe von Verbindungen berichtet, die zelluläre LDs28 reduzierten. Diese Verbindungen wurden aus einer privilegierten Substruktur-basierten Diversitätsorientierten Synthesebibliothek (pDOS) abgeleitet, die mit einer zentralen Isoxazol-Einheit und deren Substitution an den C3- und C5-Positionen durch privilegierte Strukturen wie Indol, Benzopyran, Chinolin und Pyrimidin entworfen wurde (ergänzende Abbildung). . 1). Unter ihnen zeigten nur 3-(Chinolin-6-yl)phenol-substituierte Isoxazol-Derivate eine hervorragende Wirksamkeit bei der zellulären LD-Reduktion. Diese Verbindungen zeigten jedoch ein gewisses Maß an Zytotoxizität. Um dieses Problem anzugehen, haben wir Isoxazol bioisosterisch durch 1,2,3-Triazol als strukturelle Modifikation ersetzt, um Zytotoxizität zu vermeiden und gleichzeitig die gewünschten LD-reduzierenden Aktivitäten zu verbessern29. Mit 3-(Chinolin-6-yl)phenol-substituierten Isoxazolen als Ausgangspunkt erstellten wir eine 1,4-disubstituierte 1,2,3-Triazol-Bibliothek mit Chinolin-privilegierten Strukturen für Struktur-Aktivitäts-Beziehungsstudien (SAR) ( Ergänzende Anmerkung 1). Eine Reihe von 17 Analoga wurde auf der Grundlage von 3-(Chinolin-6-yl)phenol- und 1,2,3-Triazol-Gerüsten entworfen und synthetisiert (Ergänzende Anmerkung 2). Wie im Ergänzungsschema 1 gezeigt, wurde Alkinylchinolin einer Kupfer(I)-katalysierten Klickreaktion mit verschiedenen aromatischen Aziden in Gegenwart von CuSO4·H2O und Natriumascorbat unterzogen.

Die LD-Reduktionsaktivität dieser Analoga (1–20) wurde zunächst in menschlichen HeLa-Zellen von Gebärmutterhalskrebs in einer festen Konzentration (jeweils 10 μM) untersucht, um die Wirksamkeit der LD-Reduktion zu bestimmen. Darüber hinaus wurde die Wirksamkeit durch Messung der halbmaximalen Hemmkonzentration (IC50) bestimmt (Ergänzungstabelle 1). Verbindungen mit hoher Zytotoxizität und geringer Wasserlöslichkeit wurden beim High-Content-Phänotyp-Screening ausgeschlossen. Basierend auf unserer SAR-Studie haben wir bestätigt, dass 1-(2-Trifluormethylphenyl)-4-(3-hydroxyphenylchinolon)triazol (4) unter unseren Derivaten die stärkste LD-reduzierende Aktivität aufweist und den Namen SB2301 erhielt (Abb. 1A). . Wir beobachteten eine dosisabhängige LD-Reduktionsaktivität in HeLa-Zellen mit einem IC50 von 4,4 μM 24 Stunden nach der Behandlung mit SB2301 (Abb. 1B, C). Obwohl SB2301 in hohen Konzentrationen eine gewisse Zytotoxizität aufwies (Abb. 1D), verwendeten wir SB2301 in Konzentrationen, in denen dies kein Problem darstellt, was ein Zeitfenster für die nachfolgenden biologischen Studien bietet. Wir beobachteten auch ein ähnliches Muster der LD-Reduktion in menschlichen hepatozellulären Karzinom-HepG2-Zellen (ergänzende Abbildung 2A) und Maus-Hepatozyten-AML12-Zellen (ergänzende Abbildung 2B). Im Einklang mit der Verringerung der zellulären LDs wurde der zelluläre Triglyceridgehalt (TG) dosisabhängig verringert (Abb. 1E). Basierend auf diesen Erkenntnissen führten wir eine weitere Studie durch, um den Mechanismus zu bestimmen, durch den SB2301 zelluläre LDs reduzierte.

Eine chemische Struktur von SB2301 (4). B Repräsentative LD-Fluoreszenzbilder, die während des phänotypischen Screenings aufgenommen wurden. C Die Quantifizierung der zellulären LD-Zahl in HeLa-Zellen nach 24-stündiger Behandlung mit verschiedenen SB2301-Dosen. Alle Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) angezeigt. D Dosis-Wirkungs-Kurven der Zelllebensfähigkeit nach SB2301-Behandlung für die angegebenen Zeiten in HeLa-Zellen. Alle Daten werden als Mittelwert ± SD angezeigt. E TG-Quantifizierungsergebnisse nach 24-stündiger SB2301-Behandlung in HepG2-Zellen. Alle Daten werden als Punktdiagramme mit dem Mittelwert ± SD (n = 3) dargestellt. Die Daten wurden mit einem ungepaarten T-Test analysiert. **P = 0,0068 vs. Dimethylsulfoxid (DMSO), ##P = 0,0029 vs. DMSO.

Zelluläre LD können entweder durch die Verhinderung ihrer Bildung (anaboler Weg) oder durch die Förderung ihres Abbaus (kataboler Weg) reduziert werden. Wir beobachteten keine drastischen Veränderungen in der Expression von Genen, die mit der Lipidbiosynthese zusammenhängen, bei der Behandlung mit SB2301 durch qPCR-Analyse (ergänzende Abbildung 3A) und bei Proteinen, die die TG/CE-Synthese durch Western-Blot-Analyse regulieren (ergänzende Abbildung 3B). Darüber hinaus wurde die SB2301-vermittelte LD-Reduktion durch die gleichzeitige Behandlung mit Orlistat, einem häufigen Lipaseinhibitor, nicht gehemmt (ergänzende Abbildung 3C). Stattdessen bestätigten wir, dass die Behandlung mit SB2301 den LD-Abbau über Lipophagie, einen selektiven autophagischen Prozess, aktivierte. Während des Fortschreitens der Autophagie wird das Mikrotubuli-assoziierte Protein 1 A/1B-leichte Kette 3 (LC3) I auf der Oberfläche des Phagophors lipidiert, um zu LC3 II zu werden. Laut Western-Blot-Analyse erfolgte die Umwandlung von LC3 I in II bei der Behandlung mit SB2301 sowohl dosis- als auch zeitabhängig (Abb. 2A, B). Als wir das Autophagie-bezogene Gen 5 (ATG5), eines der Schlüsselproteine ​​für die Phagophorverlängerung der Autophagie, reduzierten, wurde die SB2301-vermittelte Umwandlung von LC3 I in II vollständig abgeschafft (Abb. 2C). Anschließend untersuchten wir den SB2301-vermittelten autophagischen Fluss nach Behandlung mit Bafilomycin A1 (Baf), einem bekannten Modulator der H+-ATPase vom Vakuolentyp, der den autolysosomalen Abbau der autophagischen Fracht hemmt, indem er deren Ansäuerung verhindert und so den autophagischen Fluss im Spätstadium blockiert. Wir beobachteten eine erhöhte LC3 II-Akkumulation bei gleichzeitiger Behandlung mit SB2301 und Baf in dosisabhängiger Weise (Abb. 2D). Wir haben auch Live-Zell-Bildgebung mit dem mCherry-GFP-LC3-Protein durchgeführt (ergänzende Abbildung 4)30; Aufgrund der intrinsischen Löscheigenschaft von GFP unter sauren Bedingungen konnten wir feststellen, ob sich mCherry-GFP-fusionierte LC3-Proteine ​​entweder in Autophagosomen (neutral) oder Autolysosomen (sauer) befinden, indem wir einfach Änderungen im GFP-Signal überwachten und gleichzeitig das LC3-Protein mit verfolgten ein pH-unabhängiges mCherry-Signal. Rapamycin (Rap) aktiviert die Autophagie, indem es den Säugetierziel-Signalweg Rapamycin-Komplex 1 (mTORC1) hemmt und die Bildung roter Puncta aufgrund der GFP-Signallöschung in sauren Autolysosomen induziert. Im Gegensatz dazu stoppt die Baf-Behandlung den autophagischen Fluss im Spätstadium, indem sie die lysosomale Ansäuerung blockiert, was durch die Bildung gelber Puncta mittels Lebendzellbildgebung mit mCherry-GFP-LC3 bestätigt wurde. Basierend auf unseren Kontrollexperimenten mit dem Autophagie-Induktor (Rap) und -Inhibitor (Baf) hat SB2301 den Autophagie-Induktor phänokopiert und bestätigt, dass SB2301 die Autophagie aktiviert.

Eine Western-Blot-Analyse mit verschiedenen Dosen von SB2301, Rapamycin (Rap, 2 μM) und Bafilomycin A1 (Baf, 20 nM), behandelt in HepG2-Zellen für 12 Stunden. Western-Blot-Analyse mit 10 μM SB2301 für die angegebenen Zeiten (B), mit SB2301-Behandlung unter der Autophagie-bedingten Gen-5-(Atg5)-Knockdown-Bedingung, gefolgt von einer SB2301-Behandlung für 9 Stunden (C) und mit SB2301-Behandlung in Abwesenheit und Anwesenheit von 5 nM Baf für 6 Stunden (D). E Repräsentative Fluoreszenzbilder lebender Zellen von LC3 (rot, mCherry) und LDs (grün, SF44) auf mCherry-LC3-transfizierten HeLa-Zellen nach Behandlung mit Rapamycin (1 μM), Chloroquin (10 μM) und SB2301 (5 μM) für 12 Std. F Repräsentative Fluoreszenzbilder lebender Zellen von Lysosomen (rot, Lysotracker) und LDs (grün, SF44) nach 12-stündiger Behandlung mit Rapamycin (1 μM) und SB2301 (10 μM) auf HeLa-Zellen. G Repräsentative Immunfluoreszenzbilder von Ubiquitin (rot) und LDs (grün, BODIPY 493/503) auf HepG2-Zellen nach 12-stündiger SB2301-Behandlung (10 μM). Nachdem die Zellen fixiert waren, wurde Ubiquitin mit Anti-Ubiquitin-Antikörper markiert und LD mit BODIPY 495/503 gefärbt. H-Fluoreszenzintensitätsquantifizierung von in G aufgenommenen Bildern. Die Bilder wurden zufällig aus biologischen Dreifachkopien ausgewählt (n = 21 aus DMSO, n = 32 aus SB2301). Zytoplasmatische Ubiquitinsignale wurden als Hintergrund subtrahiert und das Fluoreszenzsignalverhältnis (Ubiquitin/LD) für jedes Pixel berechnet. Alle Daten werden als Punktdiagramme mit dem Mittelwert ± SD dargestellt. Die Daten wurden mit einem ungepaarten T-Test analysiert. ***P = 0,0001.

Anschließend überwachten wir die zelluläre Position von LD, LC3 (Autophagosom) und Lysosomen nach der SB2301-Behandlung, um festzustellen, ob LDs als Autophagiesubstrate verwendet wurden. Wie in Abb. 2E und der ergänzenden Abb. 5A gezeigt, induzierte Raf (ein Autophagie-Aktivator, kein Lipophagie-Aktivator) nicht die Umlagerung von LDs durch LC3 als LC3-vermittelte Autophagosomen-Substratauswahl. Unterdessen wurden LDs bei der Behandlung mit Chloroquin (einem Inhibitor des lysosomalen Abbaus) im Autophagosom gefangen. SB2301 induzierte die Bildung von Autophagosomen über die Aktivierung der Autophagie, was mit dem verstärkten Fluoreszenzsignal von LC3 übereinstimmte. Darüber hinaus erhöhte die SB2301-Behandlung die Co-Lokalisierung von LD mit LC3-Proteinen stärker als die Dimethylsulfoxid (DMSO)-Kontrolle, zusammen mit einer signifikanten Verringerung der LD-Fluoreszenzsignale. Insgesamt deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass SB2301 die Sequestrierung ganzer oder teilweiser LDs in Autophagosomen induziert, die schließlich mit Lysosomen verschmelzen, um LDs zu hydrolysieren (Abb. 2F und ergänzende Abb. 5B). Um festzustellen, ob SB2301 eine Autophagie in anderen Organellen als zellulären LDs induziert, haben wir den mitochondrialen DNA-Gehalt bei der Behandlung mit SB2301 gemessen und bestätigt, dass der mitochondriale Inhalt von dieser Behandlung nicht beeinflusst wurde (ergänzende Abbildung 6), was darauf hindeutet, dass SB2301 zelluläre LDs durch Auslösen von Lipophagie selektiv reduzierte.

Ubiquitinierung ist aktiv an der Erkennung selektiver Autophagieladungen beteiligt31, wie z. B. Mitochondrien32,33, Proteinaggregate34, Peroxisomen35 und Krankheitserreger36. Über Ubiquitin-vermittelte Lipophagie wurde jedoch noch nicht berichtet. Um festzustellen, ob die SB2301-vermittelte LD-Reduktion durch Lipophagie durch einen Ubiquitin-vermittelten Mechanismus reguliert wird, führten wir eine Immunfluoreszenz-Bildgebung gegen Ubiquitin in HepG2-Zellen durch. Wie in Abb. 2G, Ergänzende Abbildungen gezeigt. 7, 8: Bei der Behandlung mit SB2301 kam es im Vergleich zu der Behandlung mit DMSO zu einer erheblichen Ubiquitinierung auf der LD-Oberfläche. Als wir außerdem das Verhältnis von Ubiquitin zum LD-Signal nach Hintergrundsubtraktion mit zytoplasmatischen Ubiquitinsignalen quantifizierten, war das Verhältnis unter SB2301-behandelten Bedingungen signifikant höher (Abb. 2H), was bestätigt, dass LD-Oberflächenproteine ​​selektiver ubiquitiniert wurden als zytoplasmatische Proteine nach SB2301-Behandlung.

Um den zugrunde liegenden Mechanismus von SB2301 bei der Lipophagie zu untersuchen, führten wir eine Zielidentifizierungsstudie unter Verwendung der auf der thermischen Stabilitätsverschiebung basierenden Fluoreszenzdifferenz in der zweidimensionalen Gelelektrophorese (TS-FITGE) durch. Diese Technik basiert auf charakteristischen Veränderungen der Proteinstabilität, die durch thermische Denaturierung hervorgerufen werden, wenn das Protein spezifisch mit seinem Liganden interagiert37. Kurz gesagt wurden die mit DMSO und SB2301 behandelten Zellen einem Hitzeschock bei steigenden Temperaturen ausgesetzt und die resultierenden Lysate wurden chemisch mit Cy3- bzw. Cy5-N-Hydroxysuccinimidestern konjugiert. Danach wurden zwei Proteome (fluoreszierend markiert mit Cy3 und Cy5) aus jeder Temperaturbedingung kombiniert und durch 2D-Gelelektrophorese analysiert. Schließlich ergab die fluoreszenzbildbasierte Analyse des 2D-Gels Farbveränderungen einzelner Proteinflecken, die durch Änderungen der thermischen Stabilität eines Proteins bei der Interaktion mit SB2301 verursacht wurden.

Wie in Abb. 3A und der ergänzenden Abb. 9 gezeigt, erschienen in den 2D-Gelbildern von Proben, die bei höheren Temperaturen behandelt wurden, wiederholt etwa neun rote oder grüne Flecken, was auf eine erhöhte (rot) oder verringerte (grün) thermische Stabilität des Proteins bei SB2301-Eingriff hinweist. Vierzehn Proteinkandidaten wurden durch Massenspektrometrie identifiziert (Ergänzungstabelle 2). Ein zellulärer thermischer Verschiebungstest (CETSA) wurde an mehreren Kandidatenproteinen durchgeführt, um die Ziel-ID-Experimente zu validieren (Abb. 3B und ergänzende Abb. 10). Um die Zielproteinkandidaten zu priorisieren, führten wir eine Literaturrecherche zu ihren Funktionen durch und wählten drei Proteine ​​aus: PCYT2 (Ethanolaminphosphat-Cytidylyltransferase 2), ACSL4 (langkettige Fettsäure-CoA-Ligase 4) und IDH1 (Isocitratdehydrogenase [ NADP] zytoplasmatisch), die eng mit dem zellulären Lipidstoffwechsel verbunden sind. Anschließend überprüften wir mithilfe einer Funktionsverluststudie, ob jedes Zielprotein die Menge oder Größe der zellulären LDs beeinflussen kann. Wie in Abb. 3C und der ergänzenden Abb. 11 gezeigt, beobachteten wir, dass der zelluläre PCYT2-Spiegel umgekehrt mit den zellulären LD-Zahlen korrelierte, was darauf hindeutet, dass PCYT2 den Lipophagie-Aktivierungsmechanismus von SB2301 beeinflussen könnte.

A Überlagerte Bilder des Cy3- (grün, DMSO-behandeltes Proteom) und des Cy5-Kanals (rot, SB2301-behandeltes Proteom). Angezeigte Flecken (weißer Pfeil) wurden bei 59,1 °C rot und verschwanden dann bei 63,1 °C. B Immunblot von CETSA, der die spezifische Bindung von SB2301 an PCYT2 darstellt. 20 μM SB2301 und die negative Verbindung (10) wurden 1 Stunde lang auf HepG2-Zellen behandelt. Die C-LD-Zahl ändert sich bei der Erschöpfung von Pcyt2, Acsl4 und Idh1 unter Verwendung der jeweiligen siRNAs. HepG2-Zellen wurden 48 Stunden lang mit siRNAs transfiziert und anschließend wurden die fluoreszierenden LD-Bilder erhalten. Alle Daten werden als Punktdiagramme mit dem Mittelwert ± SD (n = 3) dargestellt. Die Daten wurden mit einem ungepaarten T-Test analysiert. *P = 0,0123 vs. si-scr. D Repräsentative Sensorgramme der Oberflächenplasmonresonanzanalyse (SPR) der Bindung von SB2301 an menschliches PCYT2. Die Gleichgewichtsdissoziationskonstante (KD) wurde nach 1:1-Anpassung mit dem kinetischen (oben) oder Affinitätsmodus (unten) berechnet.

Anschließend führten wir ein biophysikalisches Experiment durch, um die spezifische Bindung von SB2301 an PCYT2 mithilfe einer Oberflächenplasmonresonanzanalyse (SPR) zu untersuchen, und bestätigten die direkte Bindung von SB2301 an PCYT2 in einem 1:1-Bindungsmodus (Abb. 3D). Da der geschätzte Wert der Gleichgewichtsdissoziationskonstante (Kd) von SB2301 für PCYT2 ~26 μM betrug, ist PCYT2 möglicherweise nicht das einzige Proteinziel von SB2301. Seine synthetischen Analoga (3 und 10), denen die LD-reduzierende Aktivität fehlt, zeigten jedoch keine Verschiebung der thermischen Stabilität mit PCYT2 in CETSA (ergänzende Abbildung 12) und keine Bindungsereignisse in der SPR-Analyse (ergänzende Abbildung 13A, B). Im Gegensatz dazu beobachteten wir im Fall des synthetischen Analogons 14 (moderate LD-reduzierende Aktivität mit Zytotoxizität) oder 13 (minimale LD-reduzierende Aktivität) eine direkte Bindung an PCYT2 mit einer ähnlichen Tendenz zu ihrer LD-reduzierenden Aktivität (ergänzende Abbildung 13C). , D). Daher kamen wir zu dem Schluss, dass PCYT2 ein potenzielles Zielprotein sein könnte, das mit der SB2301-vermittelten Reduktion zellulärer LDs korreliert.

PCTY2 katalysiert bekanntermaßen die Synthese von CDP-Ethanolamin, einem Vorläufer der PE-Synthese im Zytosol38. Cholin/Ethanol-Amin-Phosphotransferase (CEPT) synthetisiert PE unter Verwendung von CDP-Ethanolamin auf der ER-Membran, und der PCYT2-vermittelte Schritt ist der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der zellulären PE-Synthese (Ergänzungsschema 2)39. Basierend auf diesen Informationen haben wir die Veränderungen untersucht, die auftreten können, wenn SB2301 an PCYT2 bindet. Obwohl die enzymatische Funktion von PCYT2 durch die Behandlung mit SB2301 nicht beeinträchtigt wurde (ergänzende Abbildung 14), beobachteten wir bereits nach kurzer Behandlungszeit (innerhalb von 1 Stunde) eine Translokation von PCYT2 zur LD-Oberfläche (Abb. 4A, B für SB2301, ergänzende Abbildung). . 15 für DMSO). Darüber hinaus induzierte SB2301 zeit- und dosisabhängig die Translokation von PCYT2 zur LD-Oberfläche (ergänzende Abbildung 16 und ergänzendes Video 1–4). Bemerkenswerterweise begannen sich innerhalb eines ähnlichen Zeitrahmens der PCYT2-Translokation auf die LD-Oberfläche große LDs zu bilden (Abb. 4A, C, ergänzende Abb. 7A, 17 für SB2301 und ergänzende Abb. 18 für DMSO). Daraus schlossen wir, dass eine LD-Vergrößerung durch SB2301-induzierte PCYT2-Translokation entstehen könnte, was die direkte und schnelle Zufuhr von CDP-Ethanolamin zur LD-Oberfläche und den anschließenden Anstieg von PE auf der LD-Oberfläche ermöglicht. Die wichtigsten Phospholipidkomponenten der LD-Membran sind PE und PC3. PC nimmt eine zylindrische Form an, während PE aufgrund seines kleineren Polkopfes eine konische Form annimmt40. Aufgrund der unterschiedlichen biophysikalischen Eigenschaften und Gesamtformen der beiden Phospholipide beeinflusst das PE/PC-Verhältnis in der LD-Membran die Krümmung und Größe von LD, um in einem Zustand minimaler Entropie zu bleiben40. Daher haben wir die Hypothese aufgestellt, dass SB2301 die Translokation von PCYT2 an der LD-Oberfläche induziert und dass diese räumlich-zeitliche Verlagerung von PCYT2 vorzugsweise die PE-Spiegel an der LD-Oberfläche erhöht, was folglich zur Verschmelzung instabiler kleiner LDs zu großen LDs führt, um die Oberfläche zu minimieren Spannung durch Reduzierung ihrer Krümmung (Abb. 4D). Um diese Hypothese zu testen, haben wir das PE/PC-Verhältnis in zellulären LDs gemessen. Obwohl wir keine Veränderungen in der PE- oder PC-Menge in den mit SB2301 behandelten ganzen Zellen beobachten konnten (ergänzende Abbildung 19), wurden erhebliche Erhöhungen des PE/PC-Verhältnisses der isolierten LDs beobachtet (Abb. 4E). Somit wurde die Menge an PE auf der LD-Oberfläche durch SB2301-induzierte PCYT2-Translokation erhöht, und das resultierende PE/PC-Verhältnis an der LD-Oberfläche störte deren biophysikalische Stabilität, was anschließend zur LD-Koaleszenz führte.

A Repräsentative Immunfluoreszenzbilder von PCYT2 (grün) und LD (blau, BODIPY 493/503). HepG2-Zellen wurden zu den angegebenen Zeiten mit 10 μM SB2301 behandelt. Die Zellen wurden für den PCYT2-Nachweis fixiert und immungefärbt. B Quantifizierung von PCYT2 auf der LD. Der überlagerte Bereich zwischen LD und PCYT2 bei jeder Versuchsbedingung wurde mit der ImageJ-Software analysiert. Die Bilder wurden zufällig aus biologischen Dreifachkopien ausgewählt. Alle Daten werden als Punktdiagramme mit dem Mittelwert ± SD dargestellt. Die Daten wurden mit einem ungepaarten T-Test analysiert. *P = 0,0423, **P = 0,0038, ***P = 0,0002. C Die Größenverteilung gereinigter LDs wurde durch dynamische Lichtstreuung gemessen. HepG2-Zellen wurden vor der Reinigung der zellulären LDs 9 Stunden lang mit 10 μM SB2301 behandelt. D Schematische Darstellung der LD-Koaleszenz durch Modulation ihres PE/PC-Verhältnisses. E Die Messung des PE/PC-Verhältnisses in gereinigten LDs zeigt, dass die Behandlung mit SB2301 das PE/PC-Verhältnis räumlich erhöht. Alle Daten werden als Punktdiagramme mit dem Mittelwert ± SD (n = 3) dargestellt. Die Daten wurden mit dem gepaarten T-Test analysiert. **P = 0,0077. F Der Grad des Beitrags und die verbleibenden LDs wurden zu jedem Zeitpunkt anhand von LD-Fluoreszenzbildern analysiert. Der Beitragsgrad wurde gemäß der Definition berechnet. Die Anzahl der verbleibenden LDs wurde durch Division der gesamten LD-Fläche durch die Zellzahlen ermittelt. Bei der Behandlung mit SB2301 verschob sich der Modus des blauen Diagramms (der mit SB2301 behandelte Zustand) zum größeren LD-Durchmesser und kehrte dann zu seinem ursprünglichen Wert zurück. LD-Fluoreszenzbilder wurden von HepG2-Zellen aufgenommen, die für die angegebenen Zeiten mit 20 μM SB2301 behandelt wurden. Alle Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. G, H Repräsentative LD-Fluoreszenzbilder und Quantifizierungsergebnisse an Atg5-Knockdown-HepG2-Zellen. ATG5-abgereicherte Zellen wurden mit 20 μM SB2301 48 Stunden lang behandelt. Der Grad des Beitrags der LDs wurde wie in E beschrieben analysiert. Alle Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. I, J Repräsentative LD-Fluoreszenzbilder und Quantifizierungsergebnisse von Ubb-Knockdown-HepG2-Zellen. UBB-abgereicherte Zellen wurden 48 Stunden lang mit 20 μM SB2301 behandelt. Der Grad des Beitrags der LDs wurde dann wie in E beschrieben analysiert. Alle Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt.

Um den Zusammenhang zwischen Lipophagie und dem Anstieg des PE/PC-Verhältnisses an der LD-Membran aufzuklären, haben wir die dynamischen Veränderungen der LD-Größe systematisch analysiert. Die Koaleszenz kleiner LDs während der früheren Behandlungsperiode mit SB2301 erklärte den Rückgang der zellulären LD-Zahlen, ohne den Autophagieprozess vollständig zu aktivieren (ergänzende Abbildung 2A). Der Anteil großer LDs nahm etwa nach 6 Stunden allmählich zu (Abb. 4A und ergänzende Abb. 16). Im gleichen Zeitraum wurde auch der Autophagieweg aktiviert (Abb. 2B). Durch die Analyse des Ausmaßes des Beitrags zellulärer LDs im Laufe der Zeit konnten wir eine dynamische Veränderung der zellulären LD-Volumina beobachten (Abb. 4F). Bei der Behandlung mit SB2301 kam es bis zu 18 Stunden lang zu einer LD-Koaleszenz; Danach nahm der Anteil großer LDs aufgrund des kontinuierlichen LD-Abbaus nicht mehr zu, sondern begann abzunehmen. Schließlich kehrte die LD-Größenverteilung auf ihren ursprünglichen Wert zurück, aber das gesamte zelluläre LD-Volumen verringerte sich nach 24 Stunden auf 64,2 % (Abb. 4F). Allerdings kehrte die LD-Volumenverteilung auch nach SB2301-Behandlung unter Atg5- (Abb. 4G, H und ergänzende Abb. 21 für SB2301; ergänzende Abb. 20, 21 für DMSO) oder Ubb-Knockdown-Bedingungen nicht zu ihrem ursprünglichen Muster zurück ( Abb. 4J, I und ergänzende Abb. 21 für SB2301; ergänzende Abb. 20, 21 für DMSO). Aus diesen Beobachtungen schlossen wir, dass die Behandlung mit SB2301 die Translokation von PCYT2 an der LD-Oberfläche induzierte und dass das PE/PC-Verhältnis an der LD-Membran zunahm, was zur LD-Koaleszenz führte. Die LD-Fusion über einen Anstieg des PE/PC-Verhältnisses erfolgte zunächst unabhängig von der Autophagie. Die daraus resultierenden ungünstigen großen LDs können eine Ubiquitin-vermittelte Lipophagie auslösen.

Wir führten ein Pulse-Chase-Experiment mit fluoreszenzfreien Fettsäuren41 durch, um das Schicksal der durch Lipophagie produzierten FFAs zu bestimmen. Das BODIPY-markierte FFA (BODIPY-C12) ist eines der besten Reagenzien, um die intrazelluläre Bewegung von FFA aus LD einfach durch Überwachung des Fluoreszenzsignals von BODIPY-C12 zu verfolgen. Beispielsweise können Zellen mit hohem Energiebedarf die Lipophagie aktivieren und die mitochondriale β-Oxidation von FFAs verlängern, um mehr ATPs für ihr Überleben zu produzieren42. Wenn Zellen mit BODIPY-C12 inkubiert und anschließend mit Serum abgereichert wurden, wurden in den Mitochondrien mehr FFAs gefunden als in LDs (Abb. 5A, B). In ähnlicher Weise beobachteten wir, dass die Behandlung mit SB2301 den Abbau zellulärer LDs über Lipophagie induzierte und FFAs produzierte, die sich in den Mitochondrien zur β-Oxidation ansammelten (Abb. 5A, B). Wir haben die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) von Zellen in Abwesenheit und Anwesenheit von SB2301 gemessen und bestätigt, dass die Zellen ihre freie Atemkapazität (SRC) als Reaktion auf die Behandlung mit SB2301 erhöhten (Abb. 5C, D und ergänzende Abb. 22). Zellen passen ihre Stoffwechselzustände mit erhöhtem mitochondrialem SRC bei hohem Energiebedarf oder hohen Stressbedingungen an, um sich vor Umweltreizen zu schützen43,44,45. Ähnlich wie beim SRC-Anstieg reagieren Zellen auf Umweltreize durch AMP-aktivierte Proteinkinase (AMPK), einen repräsentativen Energiesensor, und aktivieren dessen nachgeschaltete Signalübertragung, um die β-Oxidation zu regulieren46; Die Aktivierung von AMPK ermöglicht die Phosphorylierung und Inaktivierung von Acetyl-CoA-Carboxylase (ACC), einem wirksamen Inhibitor der mitochondrialen Fettsäureoxidation, was zu einer erhöhten Fettsäureoxidation führt47,48. Durch Western-Blot-Analyse haben wir bestätigt, dass AMPK und ACC durch SB2301 phosphoryliert wurden (ergänzende Abbildung 23). Der Anstieg der SRC- und AMPK-vermittelten ACC-Phosphorylierung nach der SB2301-Behandlung deutete darauf hin, dass die Zellen das Puffersystem einschalteten, um die durch SB2301-vermittelte Lipophagie produzierten FFAs zu verbrauchen oder zu entfernen, wodurch zellulärer Stress wie Lipotoxizität reduziert wurde.

A Repräsentative Fluoreszenzbilder lebender Zellen des FFA-Pulse-Chase-Assays mit BODIPY-markiertem FFA. 2 μM BODIPY-C12 wurden 21 Stunden lang auf HeLa-Zellen behandelt. Anschließend wurden die Zellen mit 5 μM SB2301 behandelt oder weitere 24 Stunden in einem serumfreien Medium inkubiert. Mitochondrien wurden mit Mitotracker und LD mit SF44 gefärbt. Die Bilder wurden zusammengeführt, indem Rot für Mitochondrien, Blau für BODIPY-C12 und Grün für LD markiert wurde. Der B-Pearson-Korrelationskoeffizient wurde berechnet, um die Kolokalisierung von BODIPY-C12- und Mitotracker-Signalen zu demonstrieren. Die Bilder wurden zufällig aus biologischen Dreifachkopien ausgewählt. Alle Daten werden als Punktdiagramme mit dem Mittelwert ± SD dargestellt. Die Daten wurden mit einem ungepaarten T-Test analysiert. **P = 0,0052 vs. DMSO, ##P = 0,0070 vs. DMSO. C Messung der Sauerstoffverbrauchsrate. AML12-Zellen wurden 24 Stunden lang mit 20 μM SB2301 behandelt. Alle Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Fäulnis + Ameise; Rotenon + Antimycin A. D Berechnete freie Atemkapazität (maximale Atemkapazität – Grundatmung) aus C. Alle Daten werden als Punktdiagramme mit dem Mittelwert ± SD dargestellt (n = 4). Die Daten wurden mit einem ungepaarten T-Test analysiert. ***P = 0,0004.

Der LD-Abbau kann ein einzigartiger und vorteilhafter Phänotyp für die Arzneimittelentwicklung sein, da eine übermäßige LD-Anreicherung in hohem Maße mit den Hauptursachen verschiedener Stoffwechselerkrankungen korreliert18. Darüber hinaus reguliert die Menge an FFAs nichtalkoholische Fettlebererkrankungen49. In diesem Zusammenhang könnte der Mechanismus der SB2301-aktivierten Lipophagie eine mögliche therapeutische Strategie sein, da SB2301 die LD effektiv reduziert und FFAs verbraucht. Um diesen neuartigen Lipophagie-Aktivierungsmechanismus als therapeutische Strategie zu untersuchen, haben wir SB2301 auf In-vitro-Krankheitsmodelle angewendet, insbesondere auf Lebersteatose. Um ein In-vitro-Steatosemodell zu entwickeln, verwendeten wir zwei Modellsysteme, indem wir HepG2-Zellen mit Ölsäure (OA)50 und Tamoxifen (TM)51 behandelten, um ein einfaches fettreiches Ernährungssystem bzw. ein schweres Steatohepatitis-System nachzuahmen. In beiden Lebersteatosemodellen reduzierte SB2301 dosisabhängig die zelluläre LD-Zahl und -Fläche (Abb. 6). Diese Ergebnisse bestätigen, dass der neu untersuchte Lipophagie-vermittelte LD-Reduktionsmechanismus als therapeutische Strategie für Stoffwechselerkrankungen, einschließlich nichtalkoholischer Fettlebererkrankung und nichtalkoholischer Steatohepatitis, eingesetzt werden könnte.

A Repräsentative Live-Zell-Fluoreszenz-LD-Bilder von SB2301 in OA- und TM-behandelten Lebersteatosemodellen. B Quantifizierungsergebnisse der zellulären LD-Anzahl und -Fläche aus A. Alle Daten werden als Punktdiagramme mit dem Mittelwert ± SD (n = 3) dargestellt. Die Daten wurden mit einem ungepaarten T-Test analysiert. ****P < 0,0001, ***P = 0,001, $$$P = 0,0002 vs. DMSO, ###P = 0,0004, **P = 0,0093 vs. DMSO.

Zelluläres LD reguliert die Energiehomöostase und den Lipidstoffwechsel, indem es seine Menge und Größe als Reaktion auf Umweltveränderungen wie Krankheitszustände und Energiebedingungen ändert52. Die LD-Forschung hat aufgrund ihrer Relevanz für pathophysiologische Erkrankungen großes Interesse in Wissenschaft und Industrie geweckt. Allerdings haben nur wenige Studien die Regulierungsmechanismen zellulärer LDs untersucht, insbesondere durch selektive Autophagie, nämlich Lipophagie. Hier haben wir ein bioaktives kleines Molekül, SB2301, entdeckt, das zelluläre LDs ohne schwere Zytotoxizität über einen phänotypbasierten Ansatz reduziert. Wir haben dann gezeigt, dass SB2301 zelluläre LDs reduziert, indem es die selektive Autophagie aktiviert, indem es die LD-Sequestrierung in Autophagosomen und Autolysosomen überwacht, was zum lysosomalen Abbau führt. Interessanterweise förderte die Behandlung mit SB2301 die Ubiquitinierung auf der LD-Oberfläche und ermöglichte so eine spezifische Substraterkennung für selektive Autophagie31,32,35, obwohl ubiquitinierte LDs und ihre Assoziation mit Lipophagie noch nicht berichtet wurden. Daher haben wir einen neuen molekularen Mechanismus der intrazellulären Ubiquitin-vermittelten Lipophagie entdeckt. Mehrere Fragen bleiben unbeantwortet, darunter die Identität ubiquitinierter Proteine ​​auf der LD-Oberfläche und der Mechanismus, durch den Phagophore die ubiquitinierten LDs erkennen und binden53. Dennoch kann SB2301 in Kombination mit quantitativer Proteomik als einzigartiges Forschungsinstrument zur Untersuchung der neuartigen Ubiquitin-vermittelten Lipophagiemechanismen dienen.

PCYT2 wurde mithilfe von TS-FITGE als Zielprotein von SB2301 identifiziert. Die Behandlung mit SB2301 induzierte die Translokation von PCYT2 zu zellulären LDs, ohne dessen enzymatische Aktivität zu beeinträchtigen. Wir glauben, dass die SB2301-vermittelte Translokation von PCYT2 auf die LD-Oberfläche einen Anstieg des PE/PC-Verhältnisses speziell bei LDs auslösen und dadurch deren biophysikalische Stabilität beeinflussen könnte. Infolgedessen verschmolz die destabilisierte LD, um ihre Krümmung zu minimieren, und die Zellen aktivieren die Lipophagie, um die Homöostase aufrechtzuerhalten, indem sie ungünstige große LDs eliminieren. Derzeit ist unklar, wie SB2301 die Translokation von PCYT2 auf die LD-Oberfläche induziert, und es muss eine PCYT2-Knockout-Studie durchgeführt werden, um die Notwendigkeit von PCYT2 für die Aktivität von SB2301 nachzuweisen. Die in dieser Studie erzielten Ergebnisse dienen jedoch als Pilotstudie zur Aufklärung des detaillierten molekularen Mechanismus der PCYT2-Translokation und der Ubiquitin-vermittelten Lipophagieprozesse.

Hier haben wir gezeigt, dass SB2301 die Membranzusammensetzung zellulärer LDs durch die räumliche Regulierung von PCYT2 verändert, das der LD-Membran direkt CDP-Ethanolamin zuführt. CEPT vermittelt die Verknüpfung von CDP-Ethanolamin mit Diacylglycerin, dem letzten Schritt der PE-Synthese, und CEPT existiert nur auf der ER-Oberfläche54. Es ist jedoch bekannt, dass CDP-Cholin nicht unbedingt CEPT benötigt, um PC auf LD zu synthetisieren. Darüber hinaus kann die Translokation der Cholinphosphat-Cytidylyltransferase (PCYT1A) zu LD selbst die PC-Menge erhöhen und die LD-Fusion verhindern55. Die Ähnlichkeit zwischen PE und PC in ihrem Biosynthesemechanismus und ihrer räumlichen Synthese56 könnte den in dieser Studie vorgeschlagenen Mechanismus unterstützen. Insgesamt induzierte SB2301 die Translokation von PCYT2, was zu einem räumlichen Anstieg des PE/PC-Verhältnisses in der LD-Membran führte. Die daraus resultierende biophysikalische Instabilität der LD-Membran führt zu einer LD-Koaleszenz und aktiviert die Ubiquitin-vermittelte Lipophagie, um die zelluläre Homöostase aufrechtzuerhalten. Weitere Proteomikstudien für das Interaktom des Zielproteins PCTY2 und die Identifizierung ubiquitinierter LD-Oberflächenproteine ​​wären unerlässlich, um zu zeigen, wie die koaleszierende LD-Oberfläche die Proteinubiquitinierung induziert, die Lipophagie aktiviert und die Schlüsselakteure in diesem Lipophagie-aktivierenden Mechanismus identifiziert. Dennoch könnte diese Ubiquitin-vermittelte Lipophagie eine neuartige Strategie zur Reduzierung des intrazellulären Lipidgehalts darstellen, ohne Lipotoxizität auszulösen, da aus abgebauten LDs produzierte FFAs in Mitochondrien verbraucht werden können, wie in dieser phänotypbasierten Studie gezeigt. Darüber hinaus wurde die zelluläre LD-Reduktion in In-vitro-Modellen für hepatische Steatose als neue Therapiestrategie zur Behandlung von durch Fettansammlung verursachten Stoffwechselerkrankungen, einschließlich nichtalkoholischer Steatohepatitis, demonstriert.

Anti-LC3B (ab51520), Anti-PCYT2 (ab126142), Anti-IDH1 (ab81653), Anti-Ubiquitin (ab7780), Anti-ATG5 (ab108327), TRITC-konjugierte Anti-Kaninchen-IgG-Sekundärantikörper (ab6718) und Anti -DGAT1 (ab178711) wurden von Abcam erworben. Anti-Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) (CST 2118), HRP-markiertes Anti-Maus-IgG (CST 7076) und HRP-markiertes Anti-Kaninchen-IgG-Sekundärantikörper (CST 7074) wurden von Cell Signaling Technology erworben. Anti-ACSL4 (sc-271800) und Anti-WDR1 (sc-393159) wurden von SantaCruz gekauft. Anti-SOAT1 (Novus Biologicals, NB400-141) wurde von Novus Biologicals bezogen. Anti-SOAT2 (Cayman, 100027) wurde von Cayman gekauft. Anti-DGAT2 (Thermo, PA5-21722) wurde von Thermo Scientific gekauft.

Das mCherry-GFP-LC3-Plasmid (pBabe-Vektor) wurde von Dr. Heesun Cheong, Abteilung für Chemische Biologie, Forschungsinstitut, National Cancer Center, Korea, bereitgestellt. Das mCherry-LC3-Plasmid wurde von Addgene (40827) erworben.

Für hochauflösende Bildgebungsexperimente wurde das Bildgebungssystem DeltaVision Elite von GE Healthcare verwendet. Die Objektivlinsen wurden mit dem Umkehrmikroskop Olympus IX-71 ausgestattet. Mit dem System wurden eine sCMOS-Kamera und ein InSightSSI-Fluoreszenzbeleuchtungsmodul ausgestattet. Für die Bildgebung lebender Zellen wurde eine CO2-Unterstützungskammer mit einem Objektiv-Lufterhitzer mit dem System installiert. Die Bilder wurden mit dem von GE Healthcare unterstützten SoftWorks-Programm analysiert.

HepG2-Zellen wurden in Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10 % (v/v) fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % (v/v) Antibiotika-Antimykotika-Lösung (AA) kultiviert. Menschliche HeLa-Gebärmutterhalskrebszellen wurden in RPMI 1640-Medium mit 10 % (v/v) FBS und 1 % AA-Lösung kultiviert. AML12-Zellen wurden in DMEM/F12 (1:1) (Gibco, 11330-032), 1× Insulin-Transferrin-Selen-G-Supplement (Gibco, 41400-045), Dexamethason (Endkonzentration 40 ng/ml), 10 % kultiviert. (v/v) FBS und 1 % (v/v) AA-Lösung. Die Zellen wurden in einer 100-mm-Zellkulturschale in einem Inkubator bei 37 °C in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO2 gehalten.

Lebende Zellen wurden mit SF44 (10 μM) und Hoechst 33342 (2 μg/ml) behandelt. Der serumfreie Zustand (als Positivkontrolle) wurde vor der Behandlung mit SF44 und Hoechst auf Vollmedium umgestellt. Nach 30-minütiger Inkubation wurde eine automatische Fluoreszenzbildgebung mit InCell Analyzer 2000 [GE Healthcare] oder DeltaVision Elite [GE Healthcare] ohne Waschen durchgeführt. Mit dem InCell Analyzer 2000 wurden automatisch Bilder von vier zufällig ausgewählten Punkten pro einzelnem Well in einer 96-Well-Platte erfasst. Die Bilder wurden im Autofokusmodus mit 20-facher Vergrößerung aufgenommen. Die Fluoreszenzbildgebung wurde mit den folgenden Filtereinstellungen durchgeführt: Anregungsemission, 430/24 nm_605/64 nm für LD; 350/50 nm_455/50 nm für Kern im InCell Analyzer 2000 oder 438/24 nm_559/38 nm für LD; 380/18 nm_435/48 nm für den Kern in DeltaVision Elite. Gemäß dem Protokoll des Herstellers wurden die Daten mit dem Programm InCell Developer analysiert. Die Fluoreszenzintensität von LD wurde mithilfe eines Granularitätsmoduls als zelluläres Organell interpretiert und die Fläche einzelner Zellen wurde durch Kernfärbung mithilfe der Kragensegmentierung erkannt.

Die Zellen wurden in einer transparenten 96-Well-Platte ausgesät und anschließend für die angegebenen Zeiten mit einer Verbindung behandelt. Der Zelllebensfähigkeitstest wurde mit dem WST-Test gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt.

HepG2-Zellen wurden auf einer Platte mit 12 Vertiefungen ausgesät, gefolgt von einer Behandlung mit den Verbindungen für die angegebene Zeit. Die Menge an Triglycerid wurde mit einem Triglycerid-Assay-Kit (Abcam, ab65336) gemäß dem Protokoll des Herstellers gemessen.

HepG2-Zellen wurden für die angegebene Zeit mit SB2301 behandelt. Die genomische DNA wurde aus HepG2-Zellen mit dem DNeasy DNA Extraction Kit (Qiagen, 69581) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. 20 ng genomische DNA wurden einer quantitativen PCR (qPCR) unterzogen. KAPA SYBR FAST ABI Prime qPCR-Mastermix (KK4605) und Vorwärts-/Rückwärtsprimer (200 nM) gegen menschliche mitochondriale DNA oder menschliches GAPDH wurden in einem Endvolumen von 20 μl mit nukleasefreiem Wasser gemischt. Die PCR wurde mit StepOnePlus (Applied Biosystems) durchgeführt und der PCR-Zyklus wurde verwendet; anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 3 Minuten, gefolgt von 40 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 3 Sekunden und Verlängerung bei 60 °C für 25 Sekunden. Die Daten wurden mit der vergleichenden CT-Methode analysiert und die mitochondrialen DNA-Spiegel auf GAPDH-Spiegel normalisiert.

Die Gesamt-mRNA wurde aus mit SB2301 behandelten HepG2-Zellen unter Verwendung des RNeasy Plus Mini-Kits (Qiagen 74134) isoliert. Die Reverse Transkriptionsreaktion (RT) wurde mit AccuPower Cycle Script RT PreMix (Bioneer, K-2044) mit 1 μg Gesamt-mRNA in einem Endvolumen von 20 μl mit nukleasefreiem Wasser unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: 12 Zyklen mit Primer-Annealing bei 30 °C °C für 1 Minute und DNA-Synthese bei 50 °C für 4 Minuten. 1 μl RT-Produkt wurde einer quantitativen PCR (qPCR) unterzogen. KAPA SYBR FAST ABI Prime qPCR-Mastermix (KK4605) und Vorwärts-/Rückwärtsprimer (200 nM) für jedes Gen wurden in einem Endvolumen von 20 μl mit nukleasefreiem Wasser gemischt. Die PCR wurde mit StepOnePlus (Applied Biosystems) durchgeführt und der PCR-Zyklus wurde verwendet; anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 3 Minuten, gefolgt von 40 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 3 Sekunden und Verlängerung bei 60 °C für 30 Sekunden. Die Daten wurden mit der vergleichenden CT-Methode analysiert und jedes Expressionsniveau wurde auf GAPDH-Niveau normalisiert.

Die Zellen wurden mit RIPA-Puffer (Radio-Immunpräzipitationsassay) (50 mM Tris, pH 7,8, 150 mM NaCl, 0,5 % Desoxycholat, 1 % IGEPAL CA-630) und einem Proteaseinhibitor-Cocktail (Roche) lysiert. Lysate wurden nach 20-minütiger Zentrifugation bei 15.000 U/min durch Übertragen des Überstands erhalten. Die Proteinkonzentration wurde mit dem BCA-Protein-Assay-Kit quantifiziert. Die gesamten Proteinprobenahmeverfahren wurden bei 4 °C durchgeführt. Vorbereitete Proteinproben wurden mit SDS-PAGE analysiert, gefolgt von einem Western-Blot-Verfahren. Proteine ​​wurden in die PVDF-Membran übertragen und diese mit 2 % BSA in TBST über 1 Stunde bei Raumtemperatur (RT) blockiert. Primärantikörper wurden über Nacht bei 4 °C behandelt [Anti-LC3B; 1:2000, Anti-ATG5; 1:1000, Anti-Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH); 1:2000, Anti-DGAT1; 1:1000, Anti-DGAT2; 1:1000, Anti-SOAT1; 1:500, Anti-SOAT2; 1:500] gefolgt von Waschen mit TBST. HRP-markierter Anti-Kaninchen-IgG oder HRP-markierter Anti-Maus-IgG-Sekundärantikörper (1:5000) wurden 1 Stunde lang bei Raumtemperatur behandelt. Nach dem Waschen mit TBST wurde die Membran mit einer ECL-Primerlösung von Amersham entwickelt. Das Chemilumineszenzsignal wurde mit dem ChemiDocMP-Bildgebungssystem gemessen.

HeLa-Zellen wurden 24 Stunden vor der Transfektion auf Lab-Tek II Chambered Coverglass mit Cover #1.5 Borosilicate Sterile/8 Well (Nunc 155409) ausgesät. Das Plasmid mCherry-GFP-LC3 oder das Plasmid mCherry-hLC3 wurde unter Verwendung des Reagenzes Lipofectamine 2000 in HeLa-Zellen transfiziert. Die Transfektion wurde gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt.

Fluoreszenzbilder von HeLa-Zellen, die mit mCherry-GFP-LC3 transfiziert waren, wurden im 60-fachen Maßstab unter Verwendung von mCherry/mCherry-, GFP/GFP-Filtersätzen (Anregung/Emission) erhalten. mCherry (Anregung: 575/25 nm, Emission: 625/45 nm); und GFP (Anregung: 475/28 nm, Emission: 525/48 nm). Die Bilder wurden mit der Dekonvolutionssoftware SoftWorks analysiert.

mCherry-hLC3-transfizierte HeLa-Zellen wurden vor der Bildgebung 30 Minuten lang mit SF44 (10 μM) behandelt. Fluoreszenzbilder wurden bei einer 100-fachen Vergrößerung unter Verwendung der Filtersätze mCherry/mCherry (Anregungsemission, 575/25 nm, 625/45 nm) und CFP/YFP (Anregungsemission, 438/24 nm, 559/38 nm) erhalten. Die Bilder wurden mit der SoftWorks-Entfaltungssoftware analysiert.

Vor der Fluoreszenzbildgebung wurden Lysosomen 1,5 Stunden lang mit Lysotracker DeepRed (50 nM, Thermo Scientific, L7528) gefärbt. LDs wurden mit SF44 (10 μM) gefärbt und Kerne wurden 30 Minuten lang mit Hoechst 33342 (2 μg/ml) gefärbt. Die Bilder wurden mit einer 100-fachen Vergrößerung unter Verwendung von Cy5/Cy5 (Anregungsemission, 632/22 nm, 676/34 nm), FITC/TRITC (Anregungsemission, 475/28 nm, 594/45 nm) und DAPI/DAPI (Anregungsemission, 380/45 nm) aufgenommen. 18 nm_435/48 nm). Die Bilder wurden mit der SoftWorks-Entfaltungssoftware analysiert.

Die Zellen wurden mit kalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und mit 4 % Paraformaldehyd in PBS fixiert. Die Zellen wurden zur Permeabilisierung 15 Minuten lang bei Raumtemperatur in 0,1 % Triton X-100 in PBS inkubiert. Die Proben wurden dreimal mit eiskaltem PBS gewaschen, gefolgt von einer einstündigen Inkubation mit 2 % BSA in PBS bei Raumtemperatur. Fixierte Zellen auf Schalen wurden der verdünnten Primärantikörperlösung (Ubiquitin; 1:300, PCYT2; 1:200) ausgesetzt ) in PBS mit 1 % BSA und 3 μM BODIPY 493/503 (Thermo, D3922) bei 4 °C über Nacht. Der primäre Antikörper wurde dekantiert und dreimal mit PBS gewaschen. Anschließend wurde eine verdünnte Anti-Kaninchen-IgG-TRITC-Antikörperlösung (1:200) mit 3 μM BODIPY 493/503 und Hoechst 33342 (2 μg/ml) auf die Proben aufgetragen und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden Fluoreszenzbilder mit der DeltaVision Elite-Fluoreszenzmikroskopie (100-fach) unter Verwendung von TRITC/TRITC (Anregungsemission, 542/27 nm, 594/45 nm) und FITC/FITC (Anregungsemission, 475/28 nm, 525/48 nm) aufgenommen ) und DAPI/DAPI (Anregung_Emission, 380/18 nm_435/48 nm). Die Bilder wurden mit der SoftWorks-Entfaltungssoftware analysiert.

Humane hepatozelluläre Karzinom-HepG2-Zellen wurden in serumfreiem DMEM mit 20 μM SB2301 (0,2 % (v/v) DMSO in der Endkonzentration) 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Die Zellen wurden 3 Minuten lang einem Hitzeschock ausgesetzt. Die resultierenden Zellen wurden 3 Minuten lang bei 25 °C stabilisiert, einmal mit PBS gewaschen und in PBS, das 0,4 % NP-40 und Proteaseinhibitor enthielt, resuspendiert. Zur Zelllyse wurden die Zellen drei Einfrier- (flüssiger Stickstoff)/Auftau-Zyklen unterzogen. Das Zelllysat wurde durch 20-minütige Zentrifugation bei 20.000 g und 4 °C geklärt. 50 mg Protein wurden ausgefällt und das verbleibende Pellet wurde in 10 μl Markierungspuffer (30 mM Tris-HCl bei pH 8,6, 2 M Thioharnstoff, 7 M Harnstoff und 4 % (w/v) CHAPS) unter Ultraschallbehandlung resuspendiert. Die löslichen Proteome wurden mit 0,4 mM Cy3-NHS (für DMSO-behandelte Gruppe) oder Cy5-NHS (für SB2301-behandelte Gruppe) gemischt und 45 Minuten bei 4 °C inkubiert. Die farbstoffkonjugierten Proteome wurden mit kaltem Aceton präzipitiert und in 75 μl Rehydratisierungspuffer (7 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff, 2 % (w/v) CHAPS, 40 mM DTT und 1 % IPG-Puffer) resuspendiert. Mit DMSO behandelte SB2301-behandelte Proben wurden gemischt und 150 μl (jeweils 75 μl für Cy3- und Cy5-markiert) Proteome wurden auf ein 24-cm-Immobiline-Drystrip-Gel [GE Healthcare] geladen. Die isoelektrische Fokussierung wurde mit Ettan IPGphor 3 [GE Healthcare] durchgeführt, gefolgt von einer zweidimensionalen SDS-PAGE mit einem Ettan DALTsix-System [GE Healthcare]. Das Gel wurde mit einem Typhoon Trio [GE Healthcare] gescannt. Für LCMS/MS wurde das Gel nach der Silberfärbung herausgeschnitten.

Die Proteinflecken aus dem silbergefärbten Gel wurden herausgeschnitten, entfärbt und mit Trypsin verdaut. Die Mischung wurde in SpeedVac eingedampft und dann in 10 % Acetonitril mit 0,1 % Ameisensäure gelöst. Die resultierenden Peptide wurden in einer Trap-Säule (180 μm × 20 mm, Symmetry C18) entsalzt und auf einer C18-Umkehrphasen-Analysesäule (75 μm × 200 mm, 1,7 μm, BEH130 C18) [Waters] mit einem Elektrospray-Ionisations-Pico getrennt Spitze (±10 μm ID) [Neues Objektiv]. Die Daten wurden vom Protein Lynx Global Server in.pkl-Dateien konvertiert und von der MASCOT-Engine mit der SwissProt-Datenbank durchsucht.

Trypsinisierte HepG2-Zellen wurden in serumfreiem DMEM-Medium mit der 20 μM-Verbindung (endgültige DMSO-Konzentration von 0,2 % (v/v)) 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Die Zellen wurden 3 Minuten lang einem Hitzeschock ausgesetzt und die Zellen wurden 3 Minuten lang bei 25 °C stabilisiert. Waschen Sie die Zelle einmal mit PBS und suspendieren Sie die Zellen mit PBS, das 0,4 % NP-40 und Proteaseinhibitor enthält. Lysezellen mit dreimaligem Einfrieren (flüssiger Stickstoff)/Auftauzyklus. Bereiten Sie lösliche Proteine ​​vor und ermitteln Sie die Proteinmenge mit Western Blot. (Primäre Antikörperverdünnung/Anti-ACSL4; 1:1000, Anti-PCYT2; 1:1000, Anti-IDH1; 1:1000, Anti-WDR1; 1:200, Anti-GAPDH; 1:2000).

20 μM si-RNA wurden 48 Stunden lang mit Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, 13778-100) gemäß den Herstellerprotokollen auf HepG2-Zellen aufgetragen.

Die Gleichgewichtsdissoziationskonstante (Kd) gegenüber PCYT2 wurde durch SPR unter Verwendung eines Biacore T100-Instruments [GE Healthcare] bestimmt. Die Carboxylgruppe auf der Oberfläche des CM5-Sensorchips wurde durch reaktiven Succinimidester unter Verwendung einer Kombination aus 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)-Carbodiimid (EDC) und N-Hydroxysuccinimid (NHS) in den Durchflusszellen 1 und 2 ersetzt . Humanes PCYT2 (Prospec, enz-221) wurde auf Durchflusszelle 2 (10.000 RU) durch die Bildung von Amidbindungen mit dem resultierenden NHS-Ester immobilisiert. Der verbleibende NHS-Ester in den Durchflusszellen 1 und 2 wurde durch Injektion mit 1 M Ethanolamin-HCl-Lösung (pH 8,0) gequencht. Während des Immobilisierungsprozesses wurde PBS als Laufpuffer verwendet. Nach der Immobilisierung wurden 60 s lang unterschiedliche Konzentrationen der Verbindungen mit einer Flussrate von 10 μL·min−1 injiziert. Bei gleicher Flussrate wurde die Dissoziation von der Sensoroberfläche 300 s lang überwacht. Als Laufpuffer verwendeten wir 1× PBS (pH 7,3) mit 3 % DMSO und 0,05 % P20. Die Bindungsereignisse wurden bei 25 °C gemessen. Die Datenanalyse wurde mit der Biacore T100-Auswertungssoftware [GE Healthcare] durchgeführt. Die endgültigen Sensorgramme wurden nach Eliminierung der Reaktionen von Durchflusszelle 1 und der Nur-Puffer-Kontrolle erhalten. Der Kd wurde berechnet, indem die Sensorgramme an ein 1:1-Bindungsmodell angepasst wurden.

Die PCYT2-Aktivität wurde wie zuvor beschrieben mit geringfügigen Änderungen getestet57. Bereiten Sie kurz gesagt eine Reaktionsmischung (50 μl) in 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,8), 5 mM DTT, 10 mM MgCl2, 650 μM Phosphoethanolamin und CTP mit verschiedenen Konzentrationen vor. Anschließend wurde die Reaktionsmischung mit 0,1 μg gereinigtem PCYT2 3 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Die Reaktionen wurden durch 2-minütiges Kochen beendet. Die Produktkonzentration (Pyrophosphat) wurde mit einem Pyrophosphat-Assay-Kit (Lonza, LT07-610) gemessen und die Reaktionsgeschwindigkeit berechnet. Dem Reaktionsgemisch wurden DMSO und SB2301 in der angegebenen Konzentration zugesetzt.

Die Bilder wurden mit der ImageJ-Software analysiert [National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA]. Hintergrundbilder des PCYT2-Kanals wurden aus der Gaußschen Unschärfe unter Verwendung von Radius 8 erhalten, und die Originalbilder des PCYT2-Kanals wurden von den Hintergrundbildern subtrahiert, um inhomogene Hintergründe zu korrigieren. Die LD-Maske wurde vorbereitet, indem das LD-Signal anhand eines Intensitätsschwellenwerts (Bild > Anpassen > Schwellenwert) unter Verwendung des Standardalgorithmus angepasst wurde. Für die LD-Kantenmaske wurde Kanten suchen (Prozess > Kanten suchen) für die LD-Bilder mit Schwellenwerten verwendet. Der überlagerte Bereich zwischen PCYT2, dessen Hintergrund korrigiert wurde, und der LD-Maske oder LD-Kantenmaske wurde mit dem Bildrechner (Prozess > Bildrechner) unter Verwendung einer UND-Verknüpfung quantifiziert. Die resultierenden Bilder wurden einem Schwellenwert unterzogen und die Fläche wurde durch „Partikel analysieren“ (Analysieren > Partikel analysieren) unter Verwendung eines Größenfilters von 5-unendlich (Pixel) quantifiziert.

LDs wurden aus HepG2-Zellen (~108 Zellen) unter Verwendung von LD-Isolierungskits (Cell Biolabs, MET-5011) gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert. Die Membran-, Zytosol- und LD-Fraktion wurden zur Reinheitsprüfung gesammelt. 1 ml Chloroform/Aceton (1:1, v/v) wurde zugegeben, um Proteine ​​und Lipide von den isolierten LDs zu trennen. Als nächstes wurde die organische Phase zur weiteren Analyse der Phospholipidzusammensetzung gesammelt. Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal mit dem Pellet, um die Lipide aufzulösen. Nach dem Entfernen der organischen Phase wurde das Pellet bei Raumtemperatur getrocknet und mit SDS-Probenahmepuffer resuspendiert, um Proteinproben für die Reinheitsprüfung vorzubereiten.

Dynamische Lichtstreuungsdaten wurden mit gereinigten LDs in einer PMMA-Küvette (Ratiolab, 2810100) von Malvern Zetasizer Nano-S erhalten. Als Dispergiermittel und Temperatur wurden Wasser bzw. 25 °C gewählt.

Um die Menge an PE und PC in der Lipidprobe zu messen, wurden ein PE-Assay-Kit (Biovision, K499) und ein PC-Assay-Kit (Biovision, K576) verwendet. Extrahierte Lipide aus Ganzzelllysaten oder gereinigten zellulären LDs wurden durch Lösungsmittelverdampfung unter Verwendung eines Rotationsverdampfers hergestellt. Gemäß den Anweisungen des Herstellers wurden zur Messung jeder Menge getrocknete Lipide verwendet, die mit PE-Assay-Puffer und PC-Assay-Puffer rekonstituiert wurden.

Zehn Fluoreszenzbilder wurden an einem Punkt mit einer Z-Tiefe von 0,8 µm aufgenommen. Projizierte Bilder wurden mit der SoftWorks-Entfaltungssoftware erstellt. Fünfzehn zufällig ausgewählte Bilder jeder Erkrankung wurden mit InCell Developer [GE Healthcare] analysiert und die Durchmesser aller im jeweiligen Bild vorhandenen LDs quantifiziert. Unter der Annahme, dass die LD eine perfekte Kugel ist, wurde das Volumen jedes Lipidtröpfchens anhand der Beziehung zwischen Radius und Volumen berechnet (V = 4/3 πr3). Die LDs wurden entsprechend der Länge des Radius in neun Gruppen eingeteilt. Die LD-Größenverteilung wurde berechnet, indem die Summe der LD-Volumina jeder Gruppe durch die Summe der Volumina der gesamten LDs dividiert wurde.

HeLa-Zellen wurden mit 2 μM BODIPY 558/568 C12 (Thermo, D3835) in Vollmedium 21 Stunden lang inkubiert. Anschließend wurden die Zellen zweimal mit Vollmedium gewaschen und eine weitere Stunde lang ohne BODIPY 558/568 C12 inkubiert. SB2301 wurde 24 Stunden lang behandelt. Zur Positivkontrolle wurden separat serumarme (16 h) Zellen hergestellt. Mitochondrien wurden mit 100 nM MitoTracker DeepRed (Thermo, M22426) markiert, und LDs wurden vor der Fluoreszenzbildgebung gleichzeitig 30 Minuten lang mit 10 μM SF44 markiert. Die Bildgebung lebender Zellen wurde innerhalb von 2 Stunden durchgeführt.

AML12-Zellen wurden auf einer Agilent Seahorse XFe24-Platte ausgesät und anschließend mit SB2301 behandelt. Eine Sensorkartusche mit Seahorse XF Calibrant (Agilent, 100840-000) wurde über Nacht bei 37 °C in einem Inkubator ohne CO2 hydratisiert. OCR wurde in Seahorse bis 1,5 μM Oligomycin, 1 μM Fluorcarbonylcyanidphenylhydrazon (FCCP) und 0,5 μM Rotenon + Antimycin A (Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit, 103015-100) mit Seahorse XFe24 [Agilent].

Die Art des verwendeten statistischen Tests und die Anzahl der biologischen Replikate sind in der Legende jeder Abbildung angegeben. Die Zahlen jedes Experiments aus jedem biologischen Replikat finden Sie in den Ergänzenden Daten 1.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Ergebnisse der Zielidentifizierungs-Proteomik (Peakdateien und Suchdateien) finden Sie unter https://doi.org/10.6084/m9.figshare.22215583.v1. Die Ergebnisse jedes biologischen Replikats werden in den Zusatzdaten 1 bereitgestellt. Weitere in dieser Studie generierte oder analysierte Daten werden in diesem Artikel oder seinen ergänzenden Informationsdateien bereitgestellt (einschließlich der nicht beschnittenen Western Blots in der ergänzenden Abbildung 24).

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Diese Arbeit wurde durch den Creative Research Initiative Grant (2014R1A3A2030423) der National Research Foundation of Korea (NRF) unterstützt, der von der koreanischen Regierung (Ministerium für Wissenschaft und IKT) finanziert wird. JP und MK waren dankbar für das Stipendium des BK21 Plus-Programms.

CRI Center for Chemical Proteomics, Department of Chemistry, Seoul National University, Seoul, 08826, Südkorea

Jinjoo Jung, Jongbeom Park, Mingi Kim und Seung Bum Park

Abteilung für Biophysik und chemische Biologie, Seoul National University, Seoul, 08826, Südkorea

Jaeyoung Ha, Hana Cho und Seung Bum Park

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JJ entwarf und führte die biologischen Experimente durch, analysierte die Daten und erstellte das Manuskript. JP, JH und HC führten die biologischen Experimente durch und analysierten die Daten. MK entwarf die Synthesemethode und führte die Synthese durch. SBP leitete die gesamte Studie und war an allen Aspekten des experimentellen Designs, der Datenanalyse und der Manuskripterstellung beteiligt. Alle Autoren haben den Text und die Abbildungen kritisch überprüft.

Korrespondenz mit Seung Bum Park.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Dieses Manuskript wurde zuvor in einer anderen Nature Portfolio-Zeitschrift rezensiert. Das Manuskript wurde ohne weitere Begutachtung bei Communications Biology als zur Veröffentlichung geeignet erachtet. Communications Biology dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteur: Manuel Breuer.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Jung, J., Park, J., Kim, M. et al. SB2301-vermittelte Störung der Membranzusammensetzung in Lipidtröpfchen induziert Lipophagie und Ubiquitinierung von Lipidtröpfchen. Commun Biol 6, 300 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04682-9

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Eingegangen: 4. Januar 2023

Angenommen: 09. März 2023

Veröffentlicht: 21. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04682-9

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