Eine quantitative Analyse verschiedener Muster, die in der Gitterlichtblattmikroskopie angewendet werden

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 4607 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Lichtblattmikroskope reduzieren Phototoxizität und Hintergrund und verbessern die Bildgebungsgeschwindigkeit im Vergleich zu Weitfeld- und Konfokalmikroskopen. Wenn es jedoch mit Gaußschen Strahlen ausgestattet ist, stehen das axiale Auflösungsvermögen eines Lichtblattmikroskops und das beobachtbare Sichtfeld in umgekehrter Beziehung zueinander. Auf geditherten optischen Gittern basierende Lichtblätter verbessern die axiale Auflösung und Strahlgleichmäßigkeit im Vergleich zu Gaußschen Strahlen durch die Verwendung axial strukturierter Beleuchtungsmuster. Diese Vorteile gehen jedoch zu Lasten einer erhöhten Gesamtbeleuchtung der Probe und einer verringerten axialen Begrenzung des Beleuchtungsmusters. Mithilfe von Simulationen und experimentellen Messungen in festen und lebenden Zellen quantifizieren wir die Unterschiede zwischen Gaußschen und Gitterlichtblättern in Bezug auf Strahlgleichmäßigkeit, axiale Auflösung, laterale Auflösung und Photobleichung. Wir zeigen, wie unterschiedliche Beleuchtungsmuster optischer Gitter so abgestimmt werden können, dass entweder die axiale Auflösung oder die optische Schnittaufteilung Vorrang haben. Abschließend stellen wir einen Ansatz vor, um sequentielle Erfassungen verschiedener Gitterlichtblattmuster mit komplementären optischen Eigenschaften spektral zu verschmelzen, um sowohl Bilder mit hoher Auflösung als auch mit niedrigem Hintergrund zu erzielen.

In den letzten zwei Jahrzehnten wurde die Lichtblattmikroskopie verwendet, um biologische Proben verschiedener Größenordnungen abzubilden, die von einzelnen Molekülen bis hin zu ganzen Organismen reichen1,2,3,4. Bei der Lichtblattmikroskopie wird nur eine dünne Ebene an der Probe beleuchtet. Dies minimiert unscharfe Beleuchtung, reduziert Photobleichung und erhöht das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) im Vergleich zu Epifluoreszenz- und konfokaler Mikroskopie. Darüber hinaus ist in der Fluoreszenzmikroskopie die Gesamtpunktspreizfunktion (PSF) ein Produkt sowohl der Anregungs- als auch der Detektions-PSFs. Wenn das Beleuchtungsmuster also mit der Detektionsschärfentiefe vergleichbar oder dünner ist, kann die Beleuchtung in einer Ebene auch die axiale Auflösung verbessern. Obwohl Punktscanverfahren wie die Konfokaltechnik auch die axiale Auflösung und die optische Schnittdarstellung erhöhen, ermöglicht die ebene Beleuchtung mit Weitfelddetektion eine 100- bis 1000-mal schnellere Bildgebungsgeschwindigkeit bei deutlich geringerer Photobleichung5.

Die gebräuchlichsten Implementierungen der Lichtblattmikroskopie verwenden Zylinderlinsen, um einen Gaußschen Strahl in eine seitlich ausgedehnte Schicht mit einem Gaußschen axialen Intensitätsprofil an der Probe zu fokussieren. Dieser Ansatz führt zu einem inhärenten Kompromiss zwischen der Dicke des Lichtblatts und seiner Ausbreitungslänge. Dünnere Gaußsche Lichtblätter bieten eine größere axiale Auflösung und optische Schnitte, allerdings auf Kosten einer kürzeren Ausbreitungslänge und eines kleineren Sichtfelds. Im Gegensatz dazu können dickere Gaußsche Lichtblätter größere Bereiche abbilden, haben aber eine geringere Auflösung und optische Schnitte. Um diese Kompromisse zu überwinden, haben mehrere Gruppen vorgeschlagen, strukturierte Lichtblätter zur Beleuchtung zu verwenden, darunter Bessel-Strahlen6,7, Luftstrahlen8,9 und optische Gitter2,10, um die axiale Auflösung von der Ausbreitungslänge des Strahls zu entkoppeln. In der Praxis würden solche idealisierten, nicht beugenden Strahlen unendlich viel Energie erfordern und könnten physikalisch nicht realisiert werden. Stattdessen werden Strahlen erzeugt, die eine Mischung aus Gaußschen und nichtbeugenden Strahlen (z. B. Bessel-Gauß oder Gitter-Gauß) sind, wobei das Beleuchtungsmuster durch eine axial verteilte Dämpfungshüllkurve begrenzt wird, um die Beleuchtungsenergie auf eine einzige Ebene zu beschränken das Exemplar. Durch Variieren der Breite der Schwächungshülle an der Probe oder gleichwertig durch Verbreiterung der Intensitätsverteilung der Beleuchtung an der hinteren Brennebene des Anregungsobjektivs entlang kz (die auch die axiale Richtung des Detektionsobjektivs ist) kann der Benutzer den Charakter abstimmen des Beleuchtungsmusters, um Ausbreitungslänge, axiale Auflösung oder optische Schnitte je nach biologischer Probe und Bildgebungszielen zu begünstigen.

In zwei neueren Arbeiten11,12 wurden die Eigenschaften nichtbeugender Strahlen im Vergleich zu Gaußschen Strahlen untersucht, wobei sowohl Simulationen11 als auch experimentelle12 (nichtbiologische) Messungen zum Einsatz kamen. Überraschenderweise deuteten diese Arbeiten darauf hin, dass quadratische optische Gitter (eine der am häufigsten verwendeten Gitterlichtplatten-Implementierungen) ähnliche Strahltaillen, PSFs und optische Übertragungsfunktionen (OTF) wie Gaußsche Strahlen hatten und dass Instrumente, die fokussierte Gaußsche Strahlen und quadratische optische Gitter verwenden, dies tun würden unterscheiden sich nicht voneinander12. Da diese Erkenntnisse im Widerspruch zu früheren Veröffentlichungen2 und unseren eigenen früheren Erfahrungen zu stehen schienen, versuchten wir, die Quelle dieser Behauptungen zu untersuchen und die Vorteile und Kompromisse zwischen Gaußschen Strahlen und Gitterlichtschichten genauer zu charakterisieren. Zu diesem Zweck nutzen wir sowohl optische Simulationen als auch experimentelle Messungen an beugungsbegrenzten Perlen und einer Vielzahl von Zellstrukturen. Wir zeigen, dass durch Variation der Begrenzungshüllkurve an der Probe (NA-Spreizung an der Eingangspupille) strukturierte Lichtblätter so abgestimmt werden können, dass sie sich eher gitterartig oder Gauß-artig verhalten. Wir haben Lichtblätter mit derselben Ausbreitungslänge verglichen und die PSF und die OTF gemessen und eine Fourier-Ebenen-Korrelation (FPC)13 durchgeführt, um die räumlichen Frequenzkorrelationen innerhalb von Bildern an mehreren Stellen entlang der Strahlausbreitungslänge zu bewerten. Wir zeigen, dass im Vergleich zu Gaußschen Strahlen sowohl quadratische als auch hexagonale Gitterlichtblätter (1) eine höhere axiale Auflösung am Strahlfokus haben und (2) diese höhere Auflösung über einen größeren Teil der Strahlausbreitung beibehalten. In beiden Fällen gehen diese Vorteile mit einer höheren Energie in den Nebenkeulen einher, die den Hauptstrahl flankieren, was zu einer erhöhten Gesamtenergiedosis für die Probe und einer verringerten optischen Schnittdarstellung führt. Vor diesem Hintergrund charakterisieren wir die Kompromisse in Bezug auf Auflösung, Photobleichung und Phototoxizität für Gaußsche, quadratische und hexagonale Gitterlichtblätter bei der Abbildung sowohl fester als auch lebender Proben auf endogenen Proteinniveaus und machen Vorschläge, wie die Lichtblattparameter optimal abgestimmt werden können eine bestimmte biologische Probe. Abschließend stellen wir die spektral gewichtete Bildfusion als einen Ansatz vor, um Bilder zu kombinieren, die mit Lichtblättern mit komplementären optischen Eigenschaften aufgenommen wurden.

Wir beginnen unsere Charakterisierung mit der Untersuchung von 20 μm langen Lichtblättern, die für die Abbildung adhärenter Zellen optimiert sind. Wir zeigen die Notation für das im Rest der Arbeit verwendete Koordinatensystem in Abb. 1a. Wir definieren die Strahllänge durch das Halbmaximum in voller Breite (FWHM) des Intensitätsprofils entlang der Ausbreitungsrichtung y (Abb. 1b, c). Wir stellen fest, dass andere Metriken zur Beschreibung der Ausbreitungslänge, beispielsweise solche, die auf optischen Schnitten11 basieren, ebenfalls ähnliche Ergebnisse liefern (Tabelle S1 und Abb. S1a). Um die optische Aufteilung verschiedener Lichtblätter zu quantifizieren, zeichnen wir außerdem sowohl das axiale Anregungsprofil als auch die kumulative Intensität entlang der axialen Richtung sowohl in der Strahlmitte als auch in der Ausbreitungslänge FWHM auf (Abb. 1d, e). Zu Beginn verglichen wir einen Gaußschen Strahl mit 0,21 NA, ein MB-Quadratgitter mit NA = 0,35/0,25 (maximale bzw. minimale NA) und ein hexagonales Gitter mit NA = 0,46/0,36. Für Gaußsche Strahlen gibt es eine einzigartige Beziehung zwischen Sigma, Strahldicke und Ausbreitungslänge14. Für MB-quadratische und hexagonale Gitterstrahlen können Strahlen mit der gleichen Ausbreitungslänge, aber mit unterschiedlicher Struktur erzeugt werden, indem die Differenz zwischen der minimalen und maximalen NA (∆NA), der auf die Probenebene ausgeübten Dämpfungshüllkurve (∆kz bei der Pupille) und dem Abstand des MB-Quadrat-Bessel-Arrays (∆kx an der Pupille). Die Auswirkung dieser Parameter für jeden Strahltyp wird im folgenden Abschnitt beschrieben. Hier haben wir einen konstanten ∆NA von 0,1 sowohl für MB-Quadrat- als auch für Sechseck-Gitterträger beibehalten und einen solchen MB-Quadrat-Gitterabstand gewählt, dass die Seitenträger knapp außerhalb des inneren Begrenzungsrings lagen, wie zuvor2. Sowohl MB-quadratische als auch hexagonale Gitter verbesserten die axiale Auflösung im Vergleich zu einem Gaußschen Strahl mit der gleichen Ausbreitungslänge (Abb. 1f, h), gemessen durch Vergleich der gesamten axialen PSF-FWHM (1,18 λ für das hexagonale Gitter, 1,62 λ für MB-Quadrat). Gitter und 1,83λ für Gauß, Tabelle S2). Diese Unterschiede wurden noch deutlicher, wenn die gesamten PSFs außerhalb des Strahlfokus verglichen wurden, beispielsweise beim Ausbreitungsprofil FWHM, das in dieser Situation 10 Mikrometer vom Strahlfokus entfernt ist (Abb. 1g, i). Die axiale FWHM der gesamten PSFs an dieser Stelle betrug 1,27 λ für das hexagonale Gitter, 1,6 λ für das MB-Quadrat-Gitter und 2,43 λ für den Gaußschen Strahl. Diagramme der Hauptkeulendicke, wie in „Methoden“ definiert, bestätigten diese Ergebnisse und zeigten, dass die Hauptkeulendickenwerte sowohl für MB-quadratische als auch für hexagonale Gitterlichtblätter über die gesamte Strahlausbreitungslänge bis zu 22λ nahezu konstant bleiben, während die Gaußsche Hauptkeulendicke um zwei zunimmt -Falten Sie diesen Bereich (Abb. S1a). Wir haben diese Ergebnisse auch experimentell für jeden der Strahlen hier wiederholt und eine sehr gute Übereinstimmung mit den optischen Simulationen gezeigt (Abb. S2). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse einen klar unterscheidbaren Unterschied zwischen Gaußschen, MB-quadratischen und hexagonalen Gitterlichtschichten. MB-quadratische und hexagonale Gitterlichtblätter haben eine höhere axiale Auflösung und behalten diese Auflösung über einen größeren Teil der Ausbreitungslänge bei als Gaußsche Strahlen. Als letztes Beispiel untersuchten wir flache Spitzenstrahlen gleicher Länge, die durch Beschneiden eines gleichmäßigen Beleuchtungsstreifens an der Pupillenebene mit einer Maske erzeugt werden. Diese Strahlen führen an der Probe zu einem elektrischen Feld, das einer Sinc-Funktion ähnelt, mit Intensitätsseitenkeulen, die zwischen denen eines Gaußschen Strahls und eines MB-Quadratgitters liegen. Flat-Top-Strahlen zeigten mittlere Eigenschaften und zeigten im Strahlfokus eine ähnliche axiale Auflösung wie Gauß, jedoch eine geringere Verschlechterung entlang der Strahlausbreitungsrichtung. Als Kompromiss hatten Strahlen mit flacher Oberseite an allen Stellen eine geringere axiale Auflösung, aber eine bessere optische Schnittteilung als MB-Quadrat- oder Sechseckgitter-Lichtblätter (Abb. S3e und Tabelle S2).

a Schematische Darstellung der Detektions- und Anregungsobjektive mit Darstellung der Koordinatenreferenzrahmen der Proben- und Pupillenebene. b Simulierte yz-Ausbreitungsprofile der drei verschiedenen Strahlen, 0 gibt den Strahlfokus an und die weiße gestrichelte Linie zeigt die Ausbreitungs-FWHM an, die Position, an der die Intensität auf 50 % des Peaks im Fokus abfällt. c Linienschnitt bei z = 0 entlang der Ausbreitungsrichtung in (b). d Linienprofil entlang z für das in b gezeigte Anregungsmuster am Strahlfokus (y = 0, obere Reihe) und am Halbwertsbreitenmaximum (FWHM) entlang der Strahlausbreitung (y = 24λ, untere Reihe). Die PSF der Weitfelderkennung wird in einer schwarzen gestrichelten Linie angezeigt. e Kumulatives Z-Achsen-Anregungsenergieprofil für die drei verschiedenen Strahlen. Das Diagramm wird am Strahlfokus (y = 0, obere Reihe) und am FWHM entlang der Strahlausbreitung (y = 24λ, untere Reihe) berechnet. f, g Gesamt-PSF für die drei verschiedenen Strahlen im Ausbreitungszentrum (y = 0) und am FWHM entlang der Strahlausbreitung (y = 24λ). h, i Axiales Linienprofil für die in (f, g) gezeigte Gesamt-PSF entlang der Linie x = 0. h ist, wenn der Strahl entlang der Ausbreitungsrichtung im Fokus ist, und i ist, wenn sich der Strahl entlang der Ausbreitungsrichtung im FWHM befindet Richtung.

Allerdings gehen die Verbesserungen der axialen Auflösung für MB-Quadratgitter, Sechseckgitter und Flat-Top-Lichtblätter alle auf Kosten einer verringerten Eingrenzung des Anregungsstrahls im Z-Profil (Abb. 1e und S3b). Das Auftragen der normalisierten integrierten Intensität entlang der axialen Richtung von z = 0 zeigt, dass die Gaußsche Strahlenergie im Vergleich zu den anderen getesteten Arten von Lichtblättern stärker eingeschränkt ist. Dies kann anhand der optischen Schnittfähigkeit quantifiziert werden, die zuvor als die Halbwertsbreite definiert wurde, innerhalb derer 63 % der kumulativen Intensität liegen11. Der optische Schnitt für den Gaußschen Strahl beträgt 0,84 λ im Vergleich zu 1,87 λ und 3,42 λ für die hier untersuchten quadratischen und hexagonalen MB-Gitter. Obwohl bei der 63 %-Grenze die optische Aufteilung des Flat-Top- und des Gaußschen Strahls ähnlich ist (Abb. S1a), zeigen Diagramme der kumulativen Z-Profil-Intensitäten von Flat-Top- und Gauß-Strahlen eine verringerte Eingrenzung für den Flat-Top-Strahl an beiden Strahlfokus und bei der Ausbreitungslänge FWHM (Abb. S3b), was die Herausforderungen bei der Auswahl eines einzelnen Grenzwerts für die Definition von Werten für die Lichtschichtdicke und den optischen Schnitt veranschaulicht. Was unsere Auflösungsvergleiche betrifft, bestätigen unsere experimentell gemessenen Anregungs-PSFs mit denselben drei Strahlen diesen Kompromiss zwischen axialer Auflösung, Ausbreitungsinvarianz und axialem Einschluss im Einklang mit unseren Simulationen (Abb. S2).

Schließlich sind Realraumvergleiche nur begrenzt in der Lage, die Auflösung vollständig zu beschreiben. Obwohl sie beispielsweise intuitiv sind, werden FWHM-Messungen im realen Raum von Inhalten mit niedriger Ortsfrequenz dominiert, die vom System effizient übertragen werden. Diese Vergleiche erfassen Änderungen in der beobachtbaren Ortsfrequenzbandbreite des Systems nicht eindeutig und erfassen auch nicht den erhöhten Informationsgehalt, der an der Probe beobachtet und durch Entfaltung neu gewichtet werden kann. Diese Merkmale lassen sich im Frequenzraum deutlicher demonstrieren, indem man die OTF des Systems vergleicht. Der Vergleich der OTFs für Gaußsche Strahlen, MB-quadratische und hexagonale Gitter ergab einen deutlichen Anstieg der axialen OTF-Unterstützung für MB-quadratische und hexagonale Gitter gegenüber Gaußschen Strahlen sowohl beim Strahlfokus als auch bei der Ausbreitungs-FWHM (Abb. 2a – f). Für diese Vergleiche wird die OTF-Achse als Bruchteil von 4π/λ aufgetragen, was dem Doppelten des Wellenvektors entspricht. Für eine gegebene Wellenlänge wird der maximale räumliche Frequenzinhalt, der durch Fluoreszenzbildgebung realisiert werden kann, durch eine Kugel mit einem Radius von 4π/λ definiert. Die Auftragung des Verhältnisses der OTF-Größe für die quadratischen und hexagonalen MB-Gitter gegen den Gaußschen Strahl äquivalenter Länge (Abb. 2b) zeigt, dass Gitterlichtschichten über einen axialen Frequenzbereich von 30 % bis 40 % von 4π/λ 10- bis zu 100-fach höhere Unterstützung als ein Gauß-Träger gleicher Länge. Diese Unterschiede sind außerhalb des Strahlfokus noch deutlicher (z. B. bei der FWHM des Intensitätsprofils entlang der Ausbreitungsrichtung y) (Abb. 2d).

a Logarithmisch skalierte simulierte Bilder der OTF-Amplitude für die drei verschiedenen Strahlen im Strahlfokus (y = 0). b Logarithmisch skalierte Bilder des Amplitudenverhältnisses zwischen der OTF für die MB-quadratischen und hexagonalen Gitterlichtschichten dividiert durch die OTF des Gaußschen Strahls am Strahlfokus (y = 0). c, d Vergleichsdiagramme zu (a, b) bei der Halbwertsbreite der Ausbreitungsrichtung (y = 24λ). e, f Axiale Profile der OTF-Amplitude entlang der Linie kx = 0 (rote Linien in a und c) am Strahlfokus (y = 0) und an der Ausbreitungs-FWHM (y = 24λ).

Angesichts der klaren Vorteile, die wir in Bezug auf Auflösung und Gleichmäßigkeit in quadratischen und hexagonalen MB-Gittern im Vergleich zu Gaußschen Strahlen sehen, die wir sowohl in unseren Simulationen als auch in experimentellen Datensätzen beobachtet haben, versuchten wir zu verstehen, warum frühere Veröffentlichungen12 diese Unterschiede nicht erkennen konnten. Wir gehen davon aus, dass dies entweder auf die spezifische Wahl der Parameter zurückzuführen ist, die in früheren Studien zur Definition und Quantifizierung der Gitterträger verwendet wurden, oder auf den spezifischen Versuchsaufbau, der für die Messungen verwendet wurde. Wie oben erwähnt, verfügen MB-Quadratgitter- und Sechseckgitterstrahlen über zusätzliche Parameter, die so abgestimmt werden können, dass es möglich ist, Lichtblätter mit unterschiedlichen Eigenschaften zu erzeugen, die alle die gleiche Ausbreitungslänge haben. Beispielsweise kann man den ∆NA dieser Strahlen erhöhen (oder verringern). Dies entspricht dem Anwenden einer engeren (oder breiteren) Dämpfungsbegrenzungshüllkurve auf die Probe. Infolgedessen werden Gitter mit größerem ∆NA eher gaußförmig, während solche mit kleinerem ∆NA eher gitterartig werden. Für eine gegebene ∆NA können Balken mit einer gegebenen Länge erreicht werden, indem die zentrale NA variiert wird, um die herum diese ∆NA berechnet wird. Niedrigere mittlere NAs führen zu längeren Strahlen und höhere mittlere NAs führen zu kürzeren Strahlen.

Wir demonstrieren diesen Effekt in den Abbildungen. S4 und S5 für 20 Mikrometer lange quadratische bzw. hexagonale MB-Gitter. Durch die gemeinsame Variation von ∆NA und der zentralen NA gehen diese 20-Mikron-Strahlen von eher gaußförmigen Strahlen mit geringerer axialer Auflösung und besserer axialer Eingrenzung zu gitterähnlicheren Strahlen mit höherer axialer Auflösung und Gleichmäßigkeit, aber geringerer Eingrenzung über. Im Frequenzraum ist der Gesamt-OTF die Faltung des Weitfelddetektions-OTF zusammen mit dem Anregungs-OTF. Die Erhöhung der zentralen NA des Anregungsmusters führt zu Kopien des Weitfelddetektions-OTF, die entlang der kz-Achse verschoben sind, was die Beobachtung von Informationen mit höherer Ortsfrequenz aus der Probe ermöglicht. Durch Erhöhen der ∆NA werden diese verschobenen Kopien entlang der kz-Achse verwischt, um den Frequenzraum vollständiger auszufüllen und die optische Schnittdarstellung zu verbessern. Wir stellen fest, dass es für MB-Quadratgitter mit einer hohen zentralen NA und einer kleinen ∆NA möglich ist, die erweiterten OTF-Ordnungen so weit zu verschieben, dass die OTF von der zentralen Keule mit der Mitte bei kz = 0 dominiert wird, was dazu führt, dass der Strahl real wird Platz, um eher Gauß-artig auszusehen (Abb. S4). Bei hexagonalen Gittern führen Einbrüche in der gesamten OTF-Unterstützung aufgrund eines kleinen ∆NA zu größeren Nebenkeulen im Anregungsprofil und einer geringeren axialen Eingrenzung (Abb. S5).

Bei MB-Quadratgittern ist ein zusätzlicher Abstimmungsparameter der Abstand des Multi-Bessel-Arrays, der die Position der beiden seitlichen Beamlets in der hinteren Pupille bestimmt. Obwohl dies technisch gesehen ein freier Parameter ist, stellen wir fest, dass der gleichmäßigste Strahl dadurch erreicht wird, dass der Strahlabstand so gewählt wird, dass die beiden seitlichen Strahlbündel den inneren Ring einschreiben. In dieser speziellen Konfiguration haben alle vier Beamlets des MB-Quadratgitters das gleiche Δky, was zu der gleichen Ausbreitungslänge an der Probe und damit zu einem äußerst konsistenten Anregungsprofil entlang der Ausbreitungsrichtung führt. Tatsächlich kann die Variation des Abstands des Multi-Bessel-Arrays auch zu einer Verschiebung der OTF-Unterstützung von einem eher Gauß-ähnlichen Lichtblatt zu einem eher gitterartigen Lichtblatt führen. Wie in Abb. S6 gezeigt, führt die Verschiebung der beiden seitlichen Beamlets nach innen, sodass sie vom inneren Ring der Maske abgeschnitten werden, zu einem sechseckigeren Lichtblatt mit verringerter axialer FWHM im Gesamt-PSF und erhöhter Modulation im Anregungsprofil ( Abb. S6e, f, i–l), während die Verschiebung der beiden seitlichen Beamlets nach außen zu einem eher Gaußschen Lichtblatt führt (Abb. S6g, h, i–l).

Diese Variablen könnten erklären, warum frühere Veröffentlichungen keinen Unterschied in der Leistung zwischen Gaußschen Strahlen und Gitterlichtblättern feststellen konnten12. Wir gehen davon aus, dass dies auf die verwendeten spezifischen Quantifizierungsmetriken oder auf die spezifischen Kombinationen von zentraler NA, ∆NA und Gitterabständen zurückzuführen sein könnte, die zum Vergleich ausgewählt wurden. Alternativ könnte diese Diskrepanz durch Nuancen des für die fragliche Studie verwendeten Versuchsaufbaus erklärt werden, bei dem die Begrenzungshülle entweder durch Beschneiden des Musters auf dem SLM oder durch Begrenzen der Upstream-Beleuchtung über Zylinderlinsen angewendet werden könnte, was möglicherweise zu einem Gitter geführt hat Muster, die einen sehr Gaußschen Charakter hatten.

Angesichts der hier beobachteten Kompromisse haben wir uns entschieden, Muster mit einem ∆NA von 0,1 für MB-quadratische und hexagonale Gitterträger weiter zu untersuchen. Diese Muster bieten einen Mittelweg zwischen einer Erhöhung der axialen Auflösung und Strahlgleichmäßigkeit, ohne dabei die Strahlbegrenzung übermäßig zu beeinträchtigen. Wir weisen jedoch darauf hin, dass die Wahl des besten Musters von der Stichprobe abhängt. Beispielsweise können dünn verteilte fluoreszierende Strukturen wie mit Clathrin beschichtete Vertiefungen, phasengetrennte Kondensate oder Mikrotubuli von der erhöhten axialen Auflösung profitieren, die weniger begrenzte optische Gitter bieten, ohne übermäßig unter unscharfer Fluoreszenz zu leiden. Im Gegensatz dazu können stark fluoreszierende Proben wie Aktin, zytoplasmatisches GFP oder dichtes Chromatin im Zellkern von begrenzteren Beleuchtungsmustern profitieren, während gleichzeitig die maximal erreichbare axiale Auflösung geopfert wird. Die Möglichkeit, zwischen Mustern abzustimmen, die diese Merkmale umfassen, ist ein Vorteil der Gitterlichtblattmikroskopie.

Angesichts der Kompromisse bei axialer Auflösung, Strahlgleichmäßigkeit und optischer Aufteilung, die jedem dieser Strahlen innewohnen, versuchten wir, ihre Leistung anhand simulierter Bilder besser zu verstehen. Wir haben Bilder erstellt, die aus mehreren Punktemittern mit einer anfänglichen Dichte von 3 Emittern/μm3 bestehen, und die Auswirkungen von Schrotrauschen, Emitterintensität und Autofluoreszenz der Probe modelliert (siehe Methoden). Schnitte dieser Bilder in der YZ-Ebene werden sowohl im Strahlfokus als auch im FWHM der Ausbreitungsachse angezeigt (Abb. 3a, b). Um die Auflösung zu quantifizieren, verwendeten wir FPC, das die Auflösung anhand der Korrelationen zwischen räumlichen Frequenzen misst, die aus mehreren unabhängigen Beobachtungen gewonnen wurden. Dies ähnelt der Fourier-Ring-Korrelation (FRC), außer dass sie die Anisotropie der Auflösung in der 3D-Bildgebung berücksichtigen kann. In der Praxis haben wir die FPC-Ebenen in ky = 0 basierend auf den rohen simulierten 3D-Bildern berechnet (Abb. 3c, d). Bei diesen Messungen wird eine höhere Auflösung als größerer Bereich innerhalb des Bereichs gemessen, in dem der FPC über einem Grenzwert von 1/713,15 bleibt. Wie in Abb. 3a dargestellt, zeigen die simulierten Bilder einen ähnlichen Trend wie in unseren Einzelperlensimulationen: Vom Gaußschen über das MB-Quadratgitter zum hexagonalen Gitter gibt es eine progressive Verbesserung der axialen Auflösung und der Gesamtauflösung, gemessen durch axiale Ausdehnung und gesamte integrierte Fläche des FPC über dem Grenzwert (Abb. 3c, e). Darüber hinaus zeigt die Auflösung bei quadratischen und hexagonalen MB-Gitterstrahlen eine geringe Verschlechterung entlang der Ausbreitungsrichtung, während die Verschlechterung bei Gaußschen Strahlen erheblicher ist (Abb. 3d, e). Wie erwartet nimmt auch der Hintergrund durch unscharfe Beleuchtung zunehmend zu, von Gaußschen über MB-Quadrat-Gitterstrahlen bis hin zu hexagonalen Gitterstrahlen. Der Nachteil dieses erhöhten Hintergrunds ist eine geringfügige Abnahme der lateralen Auflösung, während wir die verschiedenen Strahltypen durchlaufen. Ähnliche Trends beobachten wir bei der Simulation von Bildern mit erhöhter Emitterdichte (10/μm3) (Abb. S7) oder höherem Hintergrund (Signal-Hintergrund-Verhältnis von 3) (Abb. 3f).

a, b Repräsentative rohe xz-Schnittbilder im Fokus und Ausbreitungs-FWHM jedes Strahltyps. c, d Bilder der Fourier-Ebenen-Korrelation (FPC), berechnet auf der Grundlage von zwei Kopien unabhängig voneinander simulierter Bilder in (a, b). Für die FPC-Bilder von quadratischen und hexagonalen MB-Gittern zeigen wir das Verhältnis der FPC-Amplitude relativ zur Gaußschen Funktion innerhalb des Cutoff-Bereichs von 1/7. e, f Relative integrierte FPC-Fläche der simulierten Bilder an verschiedenen Orten entlang der Ausbreitungsrichtung. f Wie (e), außer berechnet mit einem niedrigeren Signal-Hintergrund-Verhältnis (SBR = 3). Relative FPC-Flächen werden als Gesamtfläche in den kx–kz-FPC-Bildern mit einem Wert größer als 1/7 berechnet und dann durch die FPC-Fläche von Gauß im Zentrum der Ausbreitung normalisiert. g, h Richard-Lucy entfaltete Bilder in (a, b).

Ähnlich wie bei der Weitfeldmikroskopie kann dieser Hintergrund rechnerisch entweder durch lineare (z. B. Wiener) oder iterative (z. B. Richardson Lucy) Dekonvolution entfernt werden. Die Dekonvolution glättet auch die nicht monoton abnehmende OTF bei der Beleuchtung mit hexagonalen Gittern und unterdrückt effektiv Beiträge der Seitenkeulen des Anregungsmusters (Abb. 3g, h für die RL-Entfaltung und Abb. S8 für die Weiner-Entfaltung). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass Bilder, die mit MB-Quadrat- und Sechseckgitter-Beleuchtungsmustern erzeugt wurden, trotz der verringerten optischen Schnitte mehr Informationen von der Probe erfassen können, was zu einer höheren Auflösung und isotroperen Bildern führt. Aufgrund der erhöhten Strahlgleichmäßigkeit wird diese erhöhte Auflösung noch deutlicher, wenn man die FWHM der Strahlausbreitungsrichtung vergleicht und wenn außerfokussierte Fluoreszenz rechnerisch entfernt wird und OTF-Ortsfrequenzen durch Entfaltung neu gewichtet werden. Wir stellten jedoch fest, dass MB-Quadrat- und Sechseckgitter-Lichtblätter zwar immer eine höhere axiale Auflösung hatten als ein Gaußscher Strahl ähnlicher Länge, die erhöhte Gesamtauflösung von MB-Quadrat- und Sechseckgitter-Lichtblättern jedoch vom Signal-Rausch-Verhältnis innerhalb der Simulation abhing Bild. Bei der Modellierung von Emittern mit einer geringeren Intensität von 100 Counts (und damit mehr Schrotrauschen) unter Beibehaltung des gleichen Signal-Hintergrund-Verhältnisses (Abb. S9) hatten Bilder von MB-quadratischen und hexagonalen Gitterlichtblättern eine höhere axiale Auflösung; Allerdings kam es im Vergleich zu Gaußschen Strahlen nicht mehr zu einem Anstieg des integrierten FPC-Signals (Abb. S9g). Dies impliziert, dass mit abnehmendem Signal-Rausch-Verhältnis der Verlust an lateraler Auflösung aufgrund der geringeren optischen Unterteilung von quadratischen oder hexagonalen MB-Gittern möglicherweise den Gewinn an axialer Auflösung bei der Berechnung der FPC-Fläche übersteigt.

Um zu überprüfen, ob die aus unseren Simulationen gezogenen Schlussfolgerungen auch in biologischen Proben bestehen bleiben, haben wir als nächstes verschiedene subzelluläre Strukturen mit denselben oben genannten Strahlen abgebildet. Wir haben uns entschieden, Chromatin im Zellkern, in den Mitochondrien und im Aktin-Zytoskelett abzubilden, Merkmale, die ein breites Spektrum an Morphologien und Dichten innerhalb der Zelle abdecken. Um einen fairen Vergleich zu gewährleisten, haben wir die Intensitäten so abgestimmt, dass jeder Strahl an der Probe die gleiche Spitzenintensität aufwies, indem wir das Signal der fluoreszierenden Kügelchen maßen, wie unter „Methoden“ beschrieben. In Abb. 4 zeigen wir rohe und RL-entfaltete YZ-Bildschnitte zusammen mit einem vergrößerten Bereich und einem Linienschnittprofil von Aktinfilamenten (Abb. 4a – e), Chromatin (Abb. 4f – j) und Mitochondrien (Abb . 4k–o) zentriert im Strahlfokus. In den rohen experimentellen Bildern bleiben die Kompromisse zwischen axialer Auflösung und Lichtblattbeschränkung gültig: Bilder, die mit quadratischen und hexagonalen MB-Gitterstrahlen aufgenommen wurden, haben eine bessere axiale Auflösung auf Kosten eines höheren Hintergrunds (diese können wiederum durch quantifiziert werden). FPC wie in Abb. S10a–c dargestellt). Zusätzlich zu diesem Hintergrund zeigen die Rohbilder auch die viellappige Struktur der Lichtblattbeleuchtung mit sechseckigem Gitter. Nach der Entfaltung sind sowohl die Hintergrund- als auch die Nebenkeulen stark reduziert (Abb. 4c, h, m). Insgesamt stimmen diese Datensätze mit den Schlussfolgerungen aus simulierten Bildern überein und weisen darauf hin, dass die Kompromisse zwischen verschiedenen Strahlen in verschiedenen festen biologischen Proben bestehen bleiben.

eine 3D-Übersicht der Aktinfilamentstrukturen in der Zelle. Der orangefarbene Umriss zeigt den ROI-Schnitt, der für (b, c) verwendet wird. b, c Rohe und RL entfaltete YZ-Schnitte, aufgenommen mit den drei verschiedenen Strahlen und einem verschmolzenen MB-Quadrat + Sechseck-Zustand. Der Cyan-Begrenzungsrahmen ist vergrößert und wird rechts angezeigt. d, e Bildintensitätsprofile für jede Bedingung entlang der roten gestrichelten Linie in b, die relativen Intensitätsdiagramme werden in willkürlichen Einheiten (au) dargestellt. f–o Vergleichbare Diagramme mit (a–e) für Bilder von Chromatin und Mitochondrien.

Wir stellten fest, dass trotz einer höheren axialen Auflösung in biologischen Proben die integrierte FPC-Fläche in MB-quadratischen und hexagonalen Gitterbildern im Vergleich zu Gauß-Bildern kleiner war (Abb. S10d), da die laterale Auflösung aufgrund des hohen Hintergrunds abnahm (ähnlich der Beobachtung). in der Mehrperlensimulation mit niedrigem Signal in Abb. S9). Diese Beobachtungen zeigen eine geringe Abhängigkeit von der Intensität der aufgenommenen Bilder (siehe Abb. S11 für Bilder, die mit einer vierfach geringeren Anregungsleistung und damit einem geringeren SNR aufgenommen wurden), was darauf hindeutet, dass bei diesen beiden Bildgebungsbedingungen ein erhöhtes Schussrauschen durch ein unscharfes Signal auftrat beeinträchtigt die seitliche Auflösung.

Um den Verlust der lateralen Auflösung aufgrund geringerer optischer Schnitte in den Gitterbeleuchtungsmodi zu beheben, schlagen wir hier vor, die Bilder aus zwei aufeinanderfolgenden Beleuchtungen der Probe mit unterschiedlichen Lichtblättern mit komplementären Eigenschaften zu kombinieren. Ähnlich wie bei anderen Multi-View-Fusion-Ansätzen, die die Probe aus mehreren Winkeln betrachten16,17, kann die Multi-Light-Sheet-Fusion mit entsprechend konstruierten Licht-Sheets Einbrüche im OTF-Raum effektiv füllen. Diese Fusionen würden dann die erhöhte axiale Auflösung und Ausbreitungsgleichmäßigkeit von MB-quadratischen und hexagonalen Gitterlichtblättern kombinieren und gleichzeitig die Abnahme der Auflösung aufgrund des erhöhten Schussrauschens aufgrund geringerer optischer Schnitte vermeiden. In unserem Ansatz erfolgt die Multi-View-Fusion ohne Entfaltung und wird im Frequenzraum durchgeführt, indem die gewichteten Summen basierend auf der OTF-Stärke des MB-Quadrats und des hexagonalen Gitters berechnet werden (Details werden unter „Methoden“ beschrieben). Dieser Ansatz berücksichtigt effektiv das spektrale Signal-Rausch-Verhältnis jedes Bildes und führt zu einem gleichmäßigeren OTF als die direkte Bildsummierung oder die inkohärente Summierung mehrerer Lichtschichten innerhalb einer einzelnen Kameraaufnahme. Wie in Abb. S12 dargestellt, füllte die spektral gewichtete Fusion von quadratischen und hexagonalen MB-Gitterbildern die OTF-Einbrüche im hexagonalen Gitter unter Beibehaltung der OTF-Ausdehnung, was zu einem PSF mit vergleichbarem axialem FWHM, aber geringeren Seitenkeulen im Vergleich zum hexagonalen Gitter führte hier verwendete Lichtfolie. Bei der Anwendung der Multi-View-Fusion auf Bilder von fixierten biologischen Proben beobachteten wir eine mit dem hexagonalen Gitter vergleichbare axiale Auflösung, jedoch weniger Hintergrund (Abb. 4), was zu einem Gesamtanstieg der FPC führte (Abb. S10a – d).

Bei der Abbildung komplizierterer Zellstrukturen stellten wir jedoch fest, dass die mit hexagonaler Gitterbeleuchtung aufgenommenen Bilder in bestimmten Fällen unerwartete räumliche Strukturen zeigten, die nicht mit einer einfachen Erhöhung der axialen Auflösung vereinbar waren. Ein Beispiel ist in Abb. S13 dargestellt, wo die untere Oberfläche des Kerns im Vergleich zu den entfalteten Bildern, die mit MB-Quadratgitter und Gaußschen Strahlen aufgenommen wurden, verschoben erscheint. Da wir sowohl in simulierten als auch in anderen experimentellen Datensätzen gezeigt haben, dass sowohl Wiener als auch iterative Dekonvolution unscharfen Hintergrund bei hexagonaler Beleuchtung ohne Artefakte wirksam unterdrücken können (Abb. S14), haben wir versucht, die Ursache dieser Diskrepanz zu verstehen. Eine Hypothese besagt, dass die Artefakte auf eine Fehlausrichtung zwischen Detektions- und Anregungsfokus zurückzuführen sind, die durch eine Abweichung des Lichtblatts beim Durchgang durch dickere Bereiche der biologischen Probe verursacht würde. Unsere simulierten Daten deuten darauf hin, dass eine solche Fehlausrichtung tatsächlich zu einer axialen Verschiebung des gesamten PSF führen und sogar zu mehrlappigen Strukturartefakten führen kann, wenn diese Fehlausrichtung besonders schwerwiegend ist (Abb. S15 und S16). Um zu testen, ob dies in unseren Bildern auftreten könnte, haben wir experimentell die relative Verschiebung zwischen Anregungs- und Detektionsbrennebene gemessen, indem wir fluoreszierende Kügelchen unter den Zellen verwendet haben (Abb. S17, Einzelheiten zu den Messungen sind in „Methoden“ beschrieben). Die Brechung zwischen dem Zellkern und dem Zellkulturmedium kann zu einem axialen Versatz von bis zu 500 nm am Boden der Zelle führen. Eine Verschiebung dieser Größenordnung würde die Gesamt-PSF verändern und möglicherweise zu Artefakten im rekonstruierten Bild führen. Diese Messungen deuten darauf hin, dass unter Umständen, in denen probeninduzierte Lichtblattversätze vernachlässigbar sind, beispielsweise bei dünnen Proben, optisch gereinigten Proben18, bei Verwendung von Zellkulturmedien mit angepasstem Index19 oder in Kombination mit adaptiver Optik zur Korrektur dieser Aberrationen10, hexagonales Gitterlicht entsteht Blätter können angewendet werden, um die axiale Auflösung zu verbessern, ohne dass Artefakte durch Nebenkeulen entstehen. Bei Experimenten, bei denen eine erhebliche probeninduzierte Strahlfehlausrichtung zu erwarten ist, ist jedoch Vorsicht geboten.

Schließlich haben wir lebende IPSc-Zellen abgebildet, die mit dem CRISPR-Cas9-Gen bearbeitet wurden, um fluoreszenzmarkierte Proteine in endogenen Mengen zu exprimieren, um die Photobleich- und Phototoxizitätseffekte der drei verschiedenen Lichtblätter zu quantifizieren. Zum Vergleich haben wir die Intensitäten verschiedener Lichtschichten so abgestimmt, dass sie über eine axiale Hüllkurve von 10 μm entweder die gleiche Spitzenintensität oder die gleiche integrierte Intensität aufweisen. Wir haben sowohl die Bildgebungsbedingungen niedriger Intensität (~0,033 µW/µm2 an der Probe und ∼60 Photonen-Peak von der Probe) als auch hoher Intensität (∼0,1 µW/µm2 an der Probe und ∼240 Photonen-Peak von der Probe) getestet (detailliert). (Ergebnisse sind in Abb. S18 und Tabelle S3 dargestellt). Wir haben iterativ 3D-Stapel lebender IPSc-Zellen abgebildet, die α-Tubulin-GFP für 700 s mit einer Rate von 0,14 Hz exprimierten, und wie in Abb. S19 gezeigt, beobachteten wir selbst bei der höchsten von uns getesteten Intensität Photobleichung, aber keine signifikante Phototoxizität Jeder der drei Strahltypen wird durch visuelle Inspektion der Veränderungen der Mikrotubuli-Dynamik beurteilt. Um das Photobleichen zu vergleichen, haben wir die Summe der Pixelintensitäten in jedem Stapel innerhalb des Zeitraffers normalisiert, diese gegen die Zeit aufgetragen und diese Kurve mit einem exponentiellen Abfall angepasst (Abb. S20). Die abklingende exponentielle Komponente wird dann an diese Daten angepasst und in Abb. 5 dargestellt. Wie dargestellt, weist der Gaußsche Strahl bei der Bildgebung mit der gleichen Spitzenintensität im Vergleich zu quadratischen und hexagonalen MB-Gittern eine geringere Photobleichung auf (Abb. 5a, c). Bei unseren Messungen von 100 aufeinanderfolgenden Volumina sinkt die Restfluoreszenz der Probe durch Gaußsche Strahlbeleuchtung auf 75 %, verglichen mit 69 % für das quadratische MB-Gitter und 62 % für das hexagonale Gitter. Dies ist wahrscheinlich auf die engere Begrenzung des axialen Anregungsprofils und die verringerte Gesamtlichtdosis bei Gaußscher Beleuchtung zurückzuführen (rechte Achse in Abb. 5a, c). In den meisten Fällen hängen die Photobleichraten weitgehend von der integrierten Intensität ab, da Lichtblätter mit derselben integrierten Intensität ähnliche Photobleichraten aufweisen (Abb. 5b). Dies scheint jedoch von der Probe und der Intensität abhängig zu sein, wie in Abb. 5d gezeigt. Wenn Mikrotubuli mit Strahlen derselben integrierten Intensität beleuchtet werden, erfolgt die Photobleichung des Gaußschen Strahls deutlich schneller, wahrscheinlich aufgrund seiner höheren momentanen Spitzenintensität im Vergleich zum MB-Quadrat und hexagonale Gitter mit der gleichen Gesamtdosis (rechte Achse in Abb. 5d).

a, b Photobleaching exponentielle Zerfallskonstanten für iPSC-Zellen, die fluoreszenzmarkiertes α-Tublin exprimieren, abgebildet durch die drei verschiedenen Strahlen. Für jede Bedingung werden fünf Zellen entnommen. Die Diagramme zeigen den Median (rote Linie), die 25- und 75-%-Quantile (blauer Kasten), den Datenbereich (Whisker) und Ausreißer (rotes Kreuz). Grüne Punkte sind auf der sekundären rechten Achse aufgetragen und zeigen die relative integrierte Intensität (oder Spitzenintensität) im Vergleich zum MB-Quadratgitter an, wenn die drei Strahlen entweder die gleiche relative Spitzenintensität (oder integrierte Intensität) aufweisen. c, d Photobleaching-Vergleiche ähnlich wie (a, b), jedoch mit höheren Beleuchtungsintensitäten ((∼0,033 µW/µm2 an der Probe für niedriges SNR vs. ∼0,1 µW/µm2 an der Probe für hohes SNR).

In diesem Artikel haben wir sowohl Simulationen als auch experimentelle Messungen durchgeführt, um die Kompromisse zwischen verschiedenen Strahlmustern zu charakterisieren, die in der Lichtblattmikroskopie verwendet werden. Wir bewerten die Strahlleistung mithilfe von Realraum-FWHM-Vergleichen, Frequenzraum-OTF-Vergleichen und FPC sowohl in simulierten Bildern bei unterschiedlichen Emitterdichten und Signal-Rausch-Verhältnissen als auch bei der Abbildung verschiedener subzellulärer Strukturen sowohl in lebenden als auch in festen Zellen. Wichtig ist, dass wir diese Messungen nicht nur am Strahlfokus, sondern auch an verschiedenen Punkten entlang der Strahlausbreitungslänge durchführen. In allen Fällen zeigen wir eine deutliche Verbesserung der axialen Auflösung und Strahlgleichmäßigkeit entlang der Ausbreitungsrichtung für MB-Quadratgitter und hexagonale Gitter im Vergleich zu Gauß- oder Flat-Top-Strahlen. Um zur Lösung früherer widersprüchlicher Erkenntnisse beizutragen, beschreiben wir, wie die verschiedenen Gittermuster für unterschiedliche Bildgebungsbedingungen optimiert werden können, indem sie so abgestimmt werden, dass sie eher Gauß-artig oder gitterartig sind.

Der Nachteil dieser Vorteile besteht darin, dass sowohl MB-Quadratgitter, hexagonale Gitter als auch Flat-Top-Strahlen im Vergleich zu Gaußschen Strahlen eine stärkere Anregung außerhalb der Ebene und eine geringere optische Aufteilung aufweisen. Bei stark fluoreszierenden Proben führt dies zu einem erhöhten Schussrauschen durch einen unscharfen Hintergrund, was zu einer Verringerung der seitlichen Auflösung und zu einer erhöhten Photobleichung bei lebenden Proben führt. Um dieses Problem anzugehen, führen wir eine Methode der spektral fusionierten Lichtblattbeleuchtung ein. Durch die spektrale Gewichtung und anschließende Summierung zweier aufeinanderfolgender Bilder, die mit Lichtschichten gleicher Länge und komplementärer optischer Eigenschaften aufgenommen wurden, kombiniert dieser Ansatz die Vorteile sowohl der MB-Quadratgitterbeleuchtung mit niedrigem Hintergrund als auch der hexagonalen Gitterbeleuchtung mit hoher axialer Auflösung.

Durch die Abbildung verschiedener Zellstrukturen zeigen wir, dass Photobleichung komplex ist und nicht nur von der Gesamtdosis, sondern auch nichtlinear von der momentanen Intensität sowie der lokalen chemischen Mikroumgebung innerhalb der Zelle abhängen kann. Für Anwendungen, bei denen Auflösung und Gleichmäßigkeit weniger wichtig sind als Photobleichung oder wenn die Verwendung weniger stabiler Fluorophore erforderlich ist, liefert ein Gauß-Strahl im Vergleich zu Strahlen mit flachem Oberteil, MB-Quadrat oder Sechseckgitter die geringste Beleuchtungsstärke für die Probe mit gleicher Ausbreitungslänge und gleicher Peakintensität. Wenn alternativ axiale Auflösung und Strahlgleichmäßigkeit wichtig sind, erfassen MB-quadratische und hexagonale Gitter oder fusionierte Bilder von beiden für einen Strahl einer bestimmten Länge mehr hochauflösende Informationen von der Probe und lösen Merkmale auf, die dies nicht wären sichtbar mit einem Gaußschen Strahl. Abhängig von den experimentellen Anforderungen können unterschiedliche Gitterlichtblätter ausgewählt werden, um diese Faktoren auszugleichen.

Alle Auflösungsvergleiche in diesem Dokument, FWHM-Profile, OTF-Messungen und FPC, werden aus den Rohdaten ohne Dekonvolution durchgeführt. Für alle verglichenen Lichtblätter können diese Bilder entweder durch lineare (z. B. Wiener) oder iterative (z. B. Richardson-Lucy (RL)) Entfaltung weiterverarbeitet werden, um die Instrumentenreaktion, einschließlich des Lichtblattprofils, zu korrigieren und ein besseres Bild wiederherzustellen genaue Schätzung der wahren Probenstruktur. Wir zeigen, dass sowohl die lineare als auch die iterative Dekonvolution in der Lage sind, unscharfe Unschärfe für alle getesteten Lichtblätter zu entfernen und bei Verwendung mit dem richtigen PSF-Modell artefaktfreie Bilder der Probe genau wiederherzustellen. Wir würden jedoch dringend davor warnen, entfaltete Bilder für den quantitativen Auflösungsvergleich zu verwenden. Eine Reihe benutzerdefinierter Parameter können sich auf das wiederhergestellte Bild auswirken und es ist nicht einfach, diese Parameter unvoreingenommen anzupassen. Man könnte beispielsweise naiv annehmen, dass die Festlegung der Anzahl der Iterationen bei der RL-Entfaltung einen unvoreingenommenen Vergleich zwischen Bedingungen ermöglichen würde. Wir haben jedoch beobachtet, dass die RL-Entfaltung für verschiedene Lichtblattprofile unterschiedlich schnell konvergiert (Abb. S21a). Wir haben uns daher dafür entschieden, die Anzahl der Iterationen für jedes Bild so zu variieren, dass unter allen Bedingungen eine konsistente Mengenkonvergenz erreicht wird. Für die lineare Wiener-Entfaltung haben wir uns entschieden, den Regularisierungsparameter des Rausch-Signal-Verhältnisses (NSR) konstant zu halten, obwohl wir beachten, dass der optimale Wert dafür sowohl von der Probenstruktur, der Photonenzahl als auch vom Lichtblattprofil abhängen kann. Aufgrund dieser Bedenken haben wir für quantitative Vergleiche nur Rohdaten verwendet und damit gezeigt, dass keine Entfaltung erforderlich ist, um den Auflösungsgewinn durch die Gitterlichtblattmikroskopie zu erzielen.

Generell möchten wir auch davor warnen, ausschließlich Realraummetriken wie die Angabe der FWHM eines Punktemitters oder der Dicke der Hauptanregungskeule zur Charakterisierung der Auflösung zu verwenden. Solche Charakterisierungen sind zwar für Gaußsche Strahlen intuitiv, können jedoch bei komplexeren Profilen stark von der Wahl des Schwellen- oder Grenzwerts abhängen (Abb. S22). Unserer Meinung nach lässt sich eine vollständige Beschreibung der Auflösung am besten im Frequenzraum charakterisieren, sowohl durch die Untersuchung des OTF als auch durch objektive Metriken, die mit Bildern biologischer Proben kompatibel sind, wie z. B. FPC. Zusammenfassend hoffen wir, dass dieser Vergleich es zukünftigen Benutzern ermöglicht, das beste Lichtblatt für ihre spezielle biologische Anwendung auszuwählen. Die Abbildung biologischer Proben ist eine komplexe und anspruchsvolle Aufgabe. Kein experimentelles Beobachtungstool ist ohne Kompromisse, aber eine klare und ausgewogene Diskussion der Kompromisse und Vorteile verschiedener Beleuchtungsprofile ermöglicht es dem Benutzer, eine fundierte Entscheidung auf der Grundlage seiner experimentellen Ziele zu treffen.

Wir simulieren das Anregungsprofil verschiedener Lichtschichten an der Probe, indem wir zunächst das komplexe elektrische Feld an der hinteren Pupille des Anregungsobjektivs definieren. Für Gaußsche und Flat-Top-Lichtblätter wird dieses komplexe elektrische Feld Fourier-transformiert und quadriert, um das Intensitätsprofil am Probenfokus zu simulieren. Um den experimentellen Prozess der Strahlbildung von MB-Quadratgittern und hexagonalen Gittern besser anzunähern, haben wir einen Zwischenschritt eingeführt, bei dem das ideale komplexe elektrische Feld auf der hinteren Pupille Fourier-transformiert wird, um das ideale elektrische Feld am Probenfokus zu simulieren. Wir nehmen dann nur die reale Komponente dieses idealen Feldes, um die Wirkung des räumlichen Lichtmodulators (SLM), der zur Erzeugung dieser Strahlen verwendet wird, experimentell zu simulieren (Abb. S23a). Da das ideale Phasenprofil des elektrischen Feldes an der Probe entweder Null oder Pi ist, ist dieser Ansatz unabhängig davon gültig, ob man einen binären oder einen Graustufen-SLM verwendet, um die Phase der reflektierten Wellenfront zu manipulieren und experimentell Gittermuster zu erzeugen. Dieses SLM-Bild wird dann invers Fourier-transformiert (Abb. S23b) und durch eine ringförmige Maske mit einer gewünschten inneren und äußeren NA-Kombination gefiltert, um die Gleichstromkomponente zu blockieren und selektiv die erste Beugungsordnung durchzulassen (Abb. S23c, d). Schließlich wird dieses gefilterte komplexe elektrische Feld ein letztes Mal Fourier-transformiert und quadriert, um das Intensitätsprofil am Probenfokus zu simulieren (Abb. S23f). Diese Schritte dienen dazu, den Lichtweg im Gitterlichtblattmikroskop zu simulieren, bei dem das Lichtblatt auf einem SLM reflektiert und dann durch eine Maske in einer konjugierten Pupillenebene gefiltert wird. Solche Schritte werden bei der Simulation von Gaußschen Lichtblättern umgangen, da sie nicht durch den SLM und die Maske gehen. Um das Anregungsprofil an verschiedenen Orten entlang der Strahlausbreitungslänge an der Probe zu simulieren, fügen wir ein komplexes Defokus-Phasenprofil \({{{{\rm{exp}}}}}}(2\pi{i}{k }_{y}\times{y})\) zum Pupillenfeld vor der Fourier-Transformation nach den Methoden von Hanser et al., wobei y den Abstand vom Strahlfokus bezeichnet und \({k}_{y }=\sqrt{1-({{k}_{x}}^{2}+{{k}_{z}}^{2})}\), ist die Projektion des Wellenvektors auf die Pupille entlang der Strahlausbreitungsrichtung20.

Wir definieren einen Gaußschen Strahl durch ein reellwertiges elektrisches Feld mit einem Gaußschen Amplitudenprofil, das im Ursprung zentriert ist und sich entlang der Linie kx = 0 in der Pupillenebene ausbreitet. Wir definieren die numerische Apertur (NA) eines Gaußschen Lichtblatts als den Wert, bei dem die Pupillenamplitude auf 1/e des zentralen Gaußschen Peaks abfällt, wobei das elektrische Feld an der hinteren Pupille einem Profil von \({E}= folgt {E}_{0}\times {{{{{\rm{exp }}}}}}(-{(\frac{{k}_{z}}{{{{{{{\rm{NA }}}}}}}})}^{2})\). Wir definieren Flat-Top-Strahlen auf ähnliche Weise als ein reellwertiges elektrisches Feld mit konstanter Amplitude entlang der Linie kx = 0 mit einer Grenz-NA an der hinteren Pupille (Abb. S24a). Quadratische Gitterlichtschichten können entweder als Interferenzmuster einer kohärenten Anordnung von Bessel-Gauss-Strahlen mit einem definierten Abstand auf der x-Achse in der Probenebene oder als kohärentes Interferenzmuster von vier Teilstrahlen erzeugt werden, die bei einer bestimmten NA in der hinteren Pupille zentriert sind und bei 0, 90, 180 und 270 Grad relativ zur Linie kx = 0 positioniert (Abb. S24b). Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass MB-Quadratgitter einer Teilmenge möglicher Quadratgitter-Lichtblätter entsprechen, wobei jedes Strahlbündel ein konstantes Intensitätsprofil entlang der kz-Richtung aufweist2. Für diese Arbeit haben wir MB-Quadrat-Gitter simuliert, indem wir zunächst das \(\Delta {{{{{{\rm{NA}}}}}}}\) der Ringmaske definiert haben. Anschließend wurden in der hinteren Pupille vier reellwertige Beamlets erzeugt. Die 0- und 180-Grad-Beamlets waren seitlich auf der Linie kx = 0 zentriert, während die 90- und 270-Grad-Beamlets axial auf der Linie kz = 0 zentriert waren. Die kx-Position der 90- und 270-Grad-Beamlets wird durch die Probe bestimmt. Der Ebenenabstand der kohärenten Bessel-Strahlen kann entweder direkt in der Pupillenebene eingestellt werden. Sofern nicht anders erwähnt und wie zuvor2 getan, haben wir die kx-Position der 90- und 270-Grad-Beamlets so eingestellt, dass sie knapp außerhalb des inneren Rings der Maske liegen. Jedes der vier Beamlets wurde dann entlang der kz-Richtung erweitert, um eine konstante reelle Amplitude zu erhalten, die durch die Abschaltung der ringförmigen Maske beschnitten wurde. Diese spezielle Konfiguration erreicht eine Konstante \({\varDelta k}_{y}=\sqrt{\left(1-{{{{{{\rm{NA}}}}}}}_{{{\min }}}}^{2}\right)}-\sqrt{\left(1-{{{{{{{\rm{NA}}}}}}}_{{{\max }}}}^ {2}\right)}\) auf der gekrümmten Pupillenoberfläche zwischen allen vier Beamlets. In diesem Zustand hat nach der Fourier-Transformation an der Probe das von allen vier Teilstrahlen beigesteuerte elektrische Feld eine gleiche Ausbreitungslänge an der Probe, was zu dem Strahl mit der größten Ausbreitungsinvariante führt. Sechseckige Gitter werden durch die Zentrierung von sechs Beamlets bei \({{{{{\rm{NA}}}}}}=\frac{{{{{{{\rm{NA}}}}}}}_{ {\max }}}+{{{{{{\rm{NA}}}}}}}_{{{\min }}}}{2}\), wobei NAmax und NAmin die äußere und innere NA sind an der Pupillenebene. Das elektrische Feld jedes Punktes in der Pupille wird zu einem Gaußschen Profil erweitert, mit \(E=\,{E}_{0}\times {{{{{\rm{exp }}}}}}(-{ (\frac{{k}_{z}}{\triangle {k}_{z}})}^{2})\). Wobei \({\triangle k}_{z}={{{{{\rm{FC}}}}}}\cdot \left({{{{{{\rm{NA}}}}}}} _{{{\max }}}-{{{{{{\rm{NA}}}}}}}_{{{\min }}}\right)\), und FC ist der Füllfaktor, der ist in unserer Simulation auf 1 gesetzt (Abb. S24c). Um experimentelles Dithering zu simulieren und ein homogenes Beleuchtungsprofil an der Probe zu erzeugen, wird das Intensitätsprofil an der Probe entlang der x-Richtung gemittelt, um die endgültige Anregungs-PSF zu erzeugen. Die Detektions-PSF wird nach den Ringfeldintegralen von Richards und Wolf mit NA = 1,0 und einem Index von 1,3321 simuliert. Anschließend wird die Gesamt-PSF als pixelweises Produkt der Anregungs- und Detektions-PSFs berechnet. Die Gesamt-OTF ist die Fourier-Transformation der Gesamt-PSF.

Um unsere simulierten PSFs zu charakterisieren, haben wir ihr Halbwertsmaß (FWHM) in voller Breite im gesamten PSF, ihren OTF-Unterstützungsbereich und ihre optische Aufteilung berechnet (Tabelle S2). Wir berechnen die Beleuchtungs-FWHM mit der Funktion „findpeaks“ in Matlab (Mathworks) basierend auf dem gesamten axialen Profil der PSFs. Diese Funktion definiert den halbmaximalen Wert anhand der Peak-Prominenz, die für die hier verwendeten axialsymmetrischen Muster als 50 % des Wertes zwischen dem zentralen Peak und dem minimalen Beleuchtungswert innerhalb von ±10λ definiert ist (Abb. S22). Der OTF-Unterstützungsbereich wird als der Frequenzbereich berechnet, in dem die OTF-Amplitude auf 0,1 % des Gleichstromwerts abfällt, und die optische Sektion wird auf der Grundlage der Halbwertsbreite berechnet, in die 63 % der kumulierten Intensität fallen (wie bei Remacha et al. 11). Um unsere Charakterisierung mit früheren veröffentlichten Ergebnissen zu vergleichen, folgten wir auch Remacha et al. und berechnete die Hauptkeulenbreite im Anregungsprofil, den optischen Schnitt und die Ausbreitungslänge basierend auf dem optischen Schnitt. In unserem Fall haben wir die Hauptkeulenbreite jedoch als die Breite definiert, bei der die Intensität auf 63 % des Peaks abfällt. Beachten Sie, dass dies ein anderer Schwellenwert ist als der in Remacha et al. verwendete. (37 %). Wir fanden heraus, dass die Verwendung eines Schwellenwerts von 37 % dazu führte, dass die Diagramme die Breite des zentralen axialen Peaks aufgrund von MB-quadratischen und hexagonalen Gittern aufgrund von Seitenkeulen in der Anregung dramatisch überschätzten (Abb. S22). Im Allgemeinen verdeutlicht diese Diskrepanz die Herausforderungen bei der Verwendung eines einzelnen Parameters (z. B. einer Grenzintensität) zur Definition nicht-Gaußscher Strahlen, weshalb wir die Verwendung objektiverer Metriken wie den Vergleich der OTF jedes Strahls entlang der Ausbreitungslänge bevorzugen. Schließlich vergleichen wir auch die Strahlausbreitungslänge, die mithilfe der Intensität FWHM definiert ist, wie wir sie hier verwendet haben, und wie sie mithilfe der Entfernung definiert ist, bei der sich die optische Schnittteilung verdoppelt, wie bei Remacha et al. und zeigen, dass diese sehr ähnliche Schätzungen der Strahllänge liefern (Tabelle S1).

Wir haben die Bildgebungsbedingungen für 3D-Volumina fluoreszierender Perlen wie folgt simuliert. Ein 3D-Volumen aus zufällig verteilten Punkten mit einer definierten Dichte wird zunächst als Ground-Truth-Bild generiert und dann mit der simulierten Gesamt-PSF (Erkennung + Anregung) aus verschiedenen Lichtschichten gefaltet. Für ein gegebenes Bild wird ein einziger Gesamt-PSF verwendet, um das gesamte 3D-Volumen zu falten, ohne PSF-Variation entlang der Ausbreitungsrichtung zu berücksichtigen. Daher wird für das simulierte Bild im Zentrum der Strahlausbreitung die Gesamt-PSF im Zentrum des Strahls und in ähnlicher Weise für das simulierte Bild im FWHM der Strahlausbreitung verwendet. Um Autofluoreszenz zu simulieren, wird dem Ground-Truth-Bild vor der PSF-Faltung ein konstantes Gaußsches Grundrauschen hinzugefügt. Um das Schrotrauschen genau zu modellieren, wird dann jedem Pixel des PSF vor der Faltung und dem simulierten Bild nach der Faltung ein unabhängiges Poisson-Rauschen hinzugefügt. Um zu vermeiden, dass in den simulierten Bildern falsche Korrelationen entstehen, wird das Poisson-Rauschen für jedes Bild und jedes PSF-Paar unabhängig abgetastet. Um die axiale und laterale Auflösung zu quantifizieren, haben wir FPC wie in Nieuwenhuizen et al.13 beschrieben auf zwei simulierte 3D-Bilder angewendet, die mit derselben Grundwahrheit und derselben PSF jeweils mit unabhängigem Poisson-Rauschen erstellt wurden. Im FPC-Diagramm definiert der Vektor, der jedes Pixel mit dem Ursprung verbindet, eine Ebene im Fourier-Raum, auf der der Korrelationskoeffizient zwischen den beiden Bildern der Intensität dieses Pixels zugeordnet wird. Wir haben die FPC-Ebene in kx = 0 und ky = 0 gemittelt und dann den Bereich berechnet, in dem der FPC-Wert größer als 1/7 ist, als Quantifizierung für die Gesamtauflösung des Bildes.

Wir haben fluoreszierende Perlen und fixierte Zellen bei Raumtemperatur in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (Corning, Artikel-Nr. 46013CM) abgebildet. Wir haben lebende Zellen bei 37 °C in 5 % CO2 in Flurobrit (Thermo Fisher, A1896701) + fötalem Rinderserum (FBS, VWR: 1500-050) + Penicillin-Streptomycin (Gibco 15140-122) abgebildet. Alle Messungen wurden mit einer modifizierten Version des in Chen et al.2 beschriebenen Instruments durchgeführt. Zu den wichtigsten Modifikationen, die für diese Arbeit relevant sind, gehört die Verwendung eines Graustufen-SLM (Meadowlark P1920-0635-HDMI), einer 0,6 NA-Anregungslinse (Thorlabs, TL20X- MPL) und ein 1,0 NA-Detektionsobjektiv (Zeiss, Objektiv W „Plan-Apochromat“ × 20/1,0, Modell Nr. 421452-9800) (Abb. 1a). Um einen ausgewogenen Vergleich zu ermöglichen, haben wir die Intensität aller Lichtschichten abgestimmt, indem wir jedes Anregungsmuster über einen axialen Bereich von 10 µm mit einer Schrittgröße von 100 nm axial verschoben haben, relativ zu einer einzelnen roten Fluoreszenzperle mit 100 nm Durchmesser (580 nm/605 nm Anregung/ Emissionswellenlänge, Thermo Fisher, F8801). Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Lichtblätter so skaliert, dass sie an der Probe die gleiche Spitzenintensität aufwiesen. Um dies zu erreichen, haben wir die relative Lichtblattintensität gemessen, indem wir die integrierte Emission der Perle an jeder Lichtblattposition aufgezeichnet haben, und dann die Einstellungen eines akusto-optischen abstimmbaren Filters angepasst, um entweder die gleiche Spitzenintensität oder die gleiche integrierte Intensität zu erreichen (wo angegeben). ) für jedes unterschiedliche Lichtblatt. Um die durchschnittliche Leistung an der Probe für jedes der verschiedenen Lichtblätter abzuschätzen, haben wir die an der Eingangspupille des Anregungsobjektivs gemessene Gesamtleistung durch eine Fläche dividiert, die durch die Lichtblattbreite (w) und die axiale Höhe für jeden Strahl bestimmt wird, wobei 90 beträgt % der Strahlenergie waren enthalten (h90) (Abb. S18 und Tabelle S3). Wir haben biologische Proben abgebildet, indem wir den Probentisch seitlich durch das Lichtblatt mit einer Schrittgröße von 200 nm (107 nm in jedem Schritt entlang der axialen Richtung des Detektionsobjektivs) abgetastet haben, vorausgesetzt, dass zwischen der Bewegung des Probentisches und dem Probentisch ein Winkel von 57,6 Grad besteht die optische Achse des Detektionsobjektivs oder äquivalent ein 32,4-Grad-Winkel zwischen der Abbildungsebene des Detektionsobjektivs und der Bewegung des Probentisches). Für die FPC-Analyse haben wir vor der Bewegung des Tisches zwei Bilder mit einer Belichtung von 20 ms an jeder Position aufgenommen. Derselbe interessierende Bereich wurde dann nacheinander mit jedem unterschiedlichen Lichtblatttyp abgebildet.

Sowohl für simulierte als auch für biologische Bilder haben wir die Richard-Lucy-Entfaltung mit der entsprechenden experimentell gemessenen Gesamt-PSF für jedes Lichtblatt angewendet. Da die experimentell aufgenommenen Rohbildstapel aufgrund des Winkels zwischen Detektions- und Probenkoordinaten verzerrt sind, werden die experimentellen Rohbilder zunächst entzerrt, bevor der Hintergrund unter Verwendung des Durchschnittswerts des Kamera-Dunkelstroms subtrahiert wird. Nach der Dunkelstromsubtraktion werden negative Pixel auf Null beschnitten und die RL-Entfaltung wird mit der integrierten Matlab-Funktion (Mathworks) „deconvlucy“ auf die entzerrten Bilder angewendet. Um den Unterschied in der Konvergenzrate verschiedener Lichtblattmuster auszugleichen (Abb. S21a) und um zu vermeiden, dass das Rauschen in Bildern durch Extrapolation über die OTF-Unterstützung hinaus verstärkt wird (Abb. S21b), haben wir die RL-Entfaltung iterativ bis zum pixelweisen quadratischen Mittelwert angewendet Der Unterschied zwischen benachbarten Iterationen fällt unter 25 % der ersten Iteration. Daher haben wir beim Entfalten von Bildern für verschiedene Lichtschichten eine unterschiedliche Anzahl von Iterationen verwendet, aber sichergestellt, dass jede Endbedingung den gleichen Konvergenzgrad erreichte. Für die Wiener-Entfaltung haben wir die in Matlab integrierte Funktion „deconvwnr“ mit NSR 0,005 für alle Bedingungen angewendet.

Wir kultivierten COS7-Zellen, die ein stabil integriertes Histon-H2B-HaloTag-Plasmid22 (Geschenk von Tim Brown am Janelia Research Campus, RRID:CVCL_0224) exprimieren, in Dulbeccos Modified Eagle Medium (Gibco 11965-092) mit 10 % FBS (VWR: 1500-050) und 1 % (v/v) 10.000 U/ml Penicillin-Streptomycin (Gibco 15140-122). Wir haben iPSC-Zellen (gekauft vom Coriell Institute for Medical Research, RRID:CVCL_IR34) aus den Zelllinien der Allen Cell Collection (mono-allelisches mEGFP-markiertes TUBA, AICS-0012) erhalten und sie in Basalmedien mit der bereitgestellten 5-fachen Ergänzung mit a kultiviert Verhältnis von 4:1 (STEMCELL Technologies 85850_c) und 1 % (v/v) 5000 U/ml Penicillin/Sreptomycin (Gibco 15070-063). Für die Bildgebung fester Zellen inkubierten wir COS7 entweder mit 250 nM Mitotracker-Orange (Thermo Fisher, M7510) in Kulturmedien zur Mitochondrienfärbung oder 250 nM JF549 in Kulturmedien zur Histonfärbung für 30 Minuten. Anschließend fixierten wir die Zellen mit 4 % Paraformaldehyd (Electron Microscopy Sciences, 15710) und 8 nM/ml Saccharose (Sigma, S7903) in Zytoskelettpuffer (bestehend aus 10 mM MES, 138 mM KCl, 3 mM MgCl und 2 mM EGTA) für 20 min bei Zimmertemperatur. Für die Aktinfärbung permeabilisierten wir die Zellen 10 Minuten lang in 0,2 % Triton-X (VWR Life Science, 0694) und blockierten sie dann 10 Minuten lang mit 2 % Rinderserumalbumin (Sigma, A9418) und 0,1 % Triton-X, bevor wir sie mit Phalloidin färbten 555 (Thermo Fisher, A34055) für 20 Minuten.

Die Multiview-Fusion der Bilder verschiedener Lichtschichten wird im Frequenzraum durchgeführt. Wir haben zunächst die mit den quadratischen und sechseckigen MB-Gitterlichtblättern aufgenommenen realen Raumbilder nach Fourier in den Frequenzraum transformiert und sie anhand ihrer Amplitude bei Gleichstrom normalisiert. Das Multiview-Fusionsbild im Frequenzraum wird dann als gewichtete Summe mit Gewichten berechnet, die durch die relative OTF-Stärke jedes Musters bestimmt werden: \({\widetilde{I}}_{{{{{{\rm{fusion}} }}}}}=\,{\widetilde{I}}_{{{{{{\rm{hex}}}}}}}\frac{{O}_{{{{{{\rm{hex }}}}}}}}{{O}_{{{{{{\rm{hex}}}}}}}+{O}_{{{{{{\rm{MB}}}}} }}}+{\widetilde{I}}_{{{{{{\rm{MB}}}}}}}\frac{{O}_{{{{{{\rm{MB}}}} }}}}{{O}_{{{{{{\rm{hex}}}}}}}+{O}_{{{{{{\rm{MB}}}}}}}}\ ), wobei \(\widetilde{I}\) die Fourier-Transformation des Bildes angibt und O die OTF angibt. \({\widetilde{I}}_{{{{{{\rm{fusion}}}}}}}\) wird dann invers Fourier-transformiert zurück in den realen Raum, um das Multi-View-Fusionsbild zu erzeugen. Wir haben festgestellt, dass diese frequenzgewichtete Bildfusion das Signal-Rausch-Verhältnis bei jeder Frequenzkomponente der verschiedenen Lichtblattmuster besser ausgleicht und zu einem glatteren endgültigen OTF führt als eine einfache Bildsummierung.

Um das Ausmaß zu messen, in dem ein Lichtblatt bei der Bildgebung durch biologische Proben abgelenkt wird, haben wir COS7-Zellen auf Deckglas kultiviert, das mit roten Fluoreszenzkügelchen mit einem Durchmesser von 100 nm vorbeschichtet und dann mit Alexa 488 Phalloidin fixiert und gefärbt wurde. Um den Lichtblattversatz unter der Probe an einer bestimmten Tischposition zu messen, haben wir zunächst das Anregungsprofil relativ zur Detektionsbrennebene axial abgetastet und das integrierte Fluoreszenzsignal aus einem kleinen Bereich (3 Pixel) um jede Perle im Feld von aufgezeichnet Sicht. Der Peak dieses Diagramms definiert die Mitte des Anregungsprofils relativ zur Position jeder Perle unter der Probe. Anschließend bestimmten wir die Position jedes Kügelchens relativ zur Brennebene des Detektionsobjektivs, indem wir das Deckglas zusammen mit der Lichtblattbeleuchtung entlang der optischen Achse des Detektionsobjektivs scannten (entspricht einer Weitfeldbeleuchtung). Der Versatz des Anregungsmusters relativ zur Brennebene des Detektionsobjektivs wird dann aus diesen Diagrammen berechnet, indem die Positionen des Lichtblatts relativ zur Perle und die Position der Perle relativ zur Fokusebene verglichen werden.

Zur Bestimmung der Stichprobengröße wurde keine statistische Methode verwendet. Zum Vergleich der Strahltypen in Datensätzen mit festen Zellen wurden die Experimente zweimal mit drei Zellen in jedem Versuch wiederholt. Es werden repräsentative Bilder einer einzelnen Zelle angezeigt. Alle Zellen zeigen den gleichen Trend. Für die Photobleich- und Phototoxizitätstests an lebenden Zellen wurden fünf Zellen aus einem einzigen Versuch gesammelt. Alle Zellen im Versuch zeigen den gleichen Trend. Aggregierte Daten sind in Abb. 5 dargestellt. Es wurden keine Daten aus den Analysen ausgeschlossen. Die Experimente waren nicht randomisiert. Die Forscher waren während der Experimente und der Ergebnisbewertung nicht blind für die Zuteilung.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die Datensätze, die den Abbildungen zugrunde liegen. 1–3 können aus dem verfügbaren Quellcode wie unten beschrieben neu generiert werden. Aufgrund von Größenbeschränkungen sind die den Abbildungen zugrunde liegenden Datensätze nicht verfügbar. 4 und 5 sowie alle ergänzenden Abbildungen (mit Ausnahme derjenigen, die aus dem Quellcode generiert werden können) sind auf Anfrage beim jeweiligen Autor frei erhältlich. Soweit möglich werden die Autoren versuchen, allen Anfragen zur Datenfreigabe innerhalb von 2 Wochen nach der ursprünglichen Anfrage nachzukommen. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Der während der aktuellen Studie generierte und/oder analysierte Quellcode ist verfügbar unter: https://github.com/legantlab/Shi_et_al_Nat_Comm_SourceCode. Der Code wird unter der MIT-Lizenz für Open-Source-Software bereitgestellt, einer freizügigen Lizenz, die von der Open Source Initiative genehmigt wurde. Spezifische Bedingungen finden Sie hier: https://opensource.org/licenses/MIT.

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Wir danken Dr. Eric Betzig für hilfreiche Diskussionen und für die Bereitstellung eines Teils des für optische Simulationen verwendeten Codes. Wir danken auch Dr. Daniel Milkie für die Unterstützung bei der Steuerungssoftware zum Betrieb des Gitterlichtblattmikroskops in dieser Arbeit. Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse der National Institutes of Health (1DP2GM136653) finanziert, die der WRLWRL für zusätzliche Unterstützung durch das Searle Scholars-Programm, das Beckman Young Investigator Program und das Packard Fellowship for Science and Engineering gewährt wurden.

Joint Department of Biomedical Engineering, University of North Carolina at Chapel Hill, North Carolina State University, Chapel Hill, NC, 27599, USA

Du Shi & Wesley R. Legant

Abteilung für Pharmakologie, University of North Carolina at Chapel Hill, Chapel Hill, NC, 27599, USA

Timothy A. Daugird und Wesley R. Legant

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YS und WRL konzipierten das Projekt und gestalteten die Studien. YS führte die Simulationen, experimentellen Messungen und Datenanalysen durch. YS und TAD bereiteten Proben für experimentelle Messungen vor. YS und WRL haben das Manuskript mit dem Feedback aller Autoren geschrieben. WRL überwachte und leitete das Projekt.

Korrespondenz mit Wesley R. Legant.

WRL ist Autor von Patenten im Zusammenhang mit der Gitterlichtblattmikroskopie und ihren Anwendungen, darunter: US-Patentnummern: US 11.221.476 B2 und US 10.795.144 B2, erteilt an WRL und Co-Autoren und übertragen an das Howard Hughes Medical Institute. YS und TAD erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Shi, Y., Daugird, TA & Legant, WR Eine quantitative Analyse verschiedener Muster, die in der Gitterlichtblattmikroskopie angewendet werden. Nat Commun 13, 4607 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32341-w

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Eingegangen: 18. Mai 2022

Angenommen: 26. Juli 2022

Veröffentlicht: 08. August 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32341-w

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